论文摘要
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）在需氧的原核生物和真核生物中广泛存在,是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化物酶。植物正常代谢过程和在各种环境下均能产生活性氧和自由基,活性氧和自由基的积累会引起结构和功能的破坏。SOD歧化超氧阴离子自由基生成过氧化氢和分子氧,在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用。SOD是一种金属酶,根据其活性位点结合的金属离子不同,SOD可分为Cu,Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD以及Ni-SOD和]Fe, Zn-SOD。其中Mn-SOD已逐渐被公认为是一种新型肿瘤抑制因子,很可能在不久的将来应用于恶性肿瘤的治疗。除此之外,Mn-SOD也被认为是一种新型抗炎症药物。本文根据已发表的大豆MnSOD基因的部分已知序列,设计引物,从以构建的克隆载体PMD18-T-MnSOD菌株中提取质粒DNA,用PCR方法获得大豆MnSOD基因的目的片段,克隆到带有高效启动子Pnmtl的粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N上,得到重组表达载体pREP5N-MnSOD。采用电穿孔转化法将重组表达质粒分别转入粟酒裂殖酵母细胞中,通过对重组粟酒裂殖酵母转化子质粒PCR和双酶切鉴定证实了转化的成功,得到了带有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母转化子。对转化子进行了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,重组质粒pREP5N-MnSOD在26KDa处有一条特异性表达带,与预计大小相符。同时,应用Native-聚丙烯酰胺凝胶电泳对转化子进行酶活性检测,经NBT染色后的凝胶,出现蓝色背景上有清晰透明的SOD活性谱带,随后用NBT光照还原法测定大豆MnSOD酶活性为120U/g,约为对照菌株的6倍。进一步说明了大豆MnSOD基因在粟酒裂殖酵母菌中成功的转录表达并具有一定的活性。随后对重组酵母菌株进行了发酵条件优化。选取表达量较大的含有大豆MnSOD基因的酵母菌进行发酵条件优化,通过测定生物量和大豆MnSOD活性确定发酵培养基成分和发酵条件,确定碳源为麦芽糖和乳糖；有机氮源为蛋白胨；无机氮源为氯化铵；无机盐为磷酸氢二钾；金属离子为硫酸锰；培养温度为31℃；起始PH=4；250ml三角瓶装瓶量为40ml；接种量为5%；转数为220r/min;表达时间为96h。通过NBT光照还原法测定大豆MnSOD活性。是优化前的2.94倍。本实验完成了大豆MnSOD基因在酵母中表达的整个过程,并优化了该工程菌的发酵条件,为下一步研究发酵罐水平的发酵条件优化奠定了基础。
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标签：锰超氧化物歧化酶论文; 粟酒裂殖酵母论文; 发酵条件论文;