论文摘要
目的:心肌梗死等缺血性心脏病严重威胁人类生存和生活质量,组织工程技术为根治心肌梗死等心脏病提供了一种新的方法,近年来,心肌组织工程有了较大的进展,但在种子细胞和支架材料等方面的难题还远没有解决。本研究在体外培养脂肪组织源间充质干细胞,诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化,探索细胞分化的机制以及力学刺激对间充质干细胞向心肌细胞分化的影响,并以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞,构建出工程化心肌组织,找出适合心肌组织工程的生物支架材料,了解力学刺激在构建工程化心肌组织中的作用。方法:取Wistar大鼠脂肪组织,以0.2%胰蛋白酶多次消化分离脂肪间充质干细胞,离心收集细胞,并用含10%胎牛血清的DMEN低糖培养液培养之,鉴定和检测细胞的特征,分别以成骨诱导液和10μmol/L的5-氮杂胞诱导液处理细胞,利用组织化学染色和免疫组化染色检测其多向分化潜能,另外,这些细胞分别经液氮冻存-复苏和长期传代后,检测细胞的分化潜能。以5-氮杂胞苷诱导剂处理24小时后,利用基底拉伸装置,向脂肪间充质干细胞施加8%、1Hz的拉伸刺激,诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化,诱导10天后用免疫组化方法,检测细胞的心肌特异蛋白和心肌发育相关基因的表达,并观察细胞的形态和搏动情况。以0.2%胰酶-0.1%胶原酶消化法分离新生大鼠心室肌细胞,经红细胞裂解液去除红细胞,离心收集细胞,以含10%或15%胎牛血清、10μmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶核苷的DMEM高糖培养基培养,先以1×106/cm2的高密度培养新生大鼠心室肌细胞,观察细胞的生长和代谢情况,通过胰蛋白酶处理,体外构建出无支架的工程化心肌薄片,经组织化学染色、免疫组化和透射电镜观察,来评价该心肌薄片。另外,将猪小肠黏膜下层通过0.25%胰蛋白酶和0.5% SDS各24小时处理,制备出脱细胞小肠黏膜下层,用材料试验机沿平行于管腔进行单轴拉伸,检测其力学性能,同时检测其细胞毒性和组织相容性。将新生大鼠心室肌细胞接种在脱细胞小肠黏膜下层上,构建出工程化心肌组织薄片,同时向该工程化心肌薄片施加8%、2Hz的拉伸刺激,观察该薄片的搏动情况,经组织化学染色、免疫组化,来评价该心肌薄片。结果:体外培养的细胞有克隆形成能力,CD13、CD44、CD29均为阳性,经成骨诱导液诱导,可表达碱性磷酸酶和骨钙蛋白并有少量胞外钙沉积,经5-氮杂胞苷诱导,细胞均表达NKx2.5、肌节型肌动蛋白和连接蛋白Cx43,有一些细胞可搏动。经液氮冻存6月后复苏或传到第九代后,这些细胞经成骨诱导或5-氮杂胞苷诱导仍可表现出成骨细胞特征或心肌细胞样特征。经5-氮杂胞苷诱导后细胞开始表达心肌特异蛋白（蛋白肌节型肌动蛋白、连接蛋白Cx43）和心肌发育相关蛋白（GATA4、骨形成蛋白2和NKx2.5）,不表达骨骼肌快肌肌浆球蛋白（一种骨骼肌蛋白）,随培养时间,这些蛋白表达量增加,3周后有肌小管结构形成并可见细胞搏动,先经5-氮杂胞苷诱导,再经拉伸刺激,细胞心肌特异蛋白（蛋白肌节型肌动蛋白、连接蛋白Cx43）和心肌发育相关蛋白（GATA4、骨形成蛋白2）表达增加,未经5-氮杂胞苷诱导,单独施加拉伸刺激后,细胞心肌特异和心肌发育相关蛋白表达很少。在1×106/cm2的高密度下培养的新生大鼠心室肌细胞生长良好,细胞搏动频率约120次/min,细胞相互重叠,细胞代谢旺盛,葡萄糖消耗量和乳酸产量远大于相同密度下培养的成纤维细胞,无支架心肌薄片可自发搏动并自发卷为管状,这些薄片由3-5层细胞组成,胞外有大量胶原,这些薄片表达肌节型肌动蛋白、层粘连蛋白、平滑肌肌动蛋白和八因子相关蛋白,透射电镜观察表明该薄片中的很多细胞中有排列有序的肌丝结构并有大量线粒体。脱细胞小肠黏膜下层在15%应变以内,力学性能比较一致,应力-应变之间为近似直线关系,该材料无细胞毒性、未见炎性反应,以该材料为支架,构建的工程化心肌组织薄片可在体外搏动3周,力学刺激可显著提高该心肌薄片的搏动频率,这种薄片由十多层细胞构成,有胞外胶原,也表达肌节型肌动蛋白、平滑肌肌动蛋白和八因子相关蛋白。结论:本实验所培养的细胞为脂肪组织源性间充质干细胞,有多向分化潜能,能向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可使这些间充质干细胞向心肌样细胞分化,而不会向骨骼肌细胞分化。经冻存或长期传代后仍能保持这种分化潜能,这些细胞可仍向心肌样细胞分化。在体外向心肌细胞分化过程中,脂肪间充质干细胞的心肌发育相关基因的表达与分化的效果之间存在密切的时间-量效关系,与体内心脏发育的过程有一些相同的途径,先经5-氮杂胞苷诱导后,再经拉伸刺激可促进干细胞向心肌细胞分化,而单独拉伸刺激对干细胞向心肌细胞分化的作用很微弱,力学刺激可能不能决定脂肪间充质干细胞向心肌样细胞分化,但能促进其分化。新生大鼠心室肌细胞在1×106/cm2的高密度下,是一种准三维培养,相当于培养了心肌薄片,在此基础上建立了一种简便的无支架心肌组织工程技术,构建了一种无支架工程化心肌组织薄片;制备出力学性能和生物相容性良好的小肠粘膜下层生物支架材料,并以其为支架成功构建出可长期搏动的工程化心肌组织薄片,力学刺激在这种工程化心肌组织构建方面起至关重要的作用,可大幅度提高工程化心肌组织的功能。