盐胁迫诱导水稻根尖细胞质膜蛋白差异表达及LRR型受体蛋白激酶的功能研究

论文摘要

以粳稻推广品种徐稻三号为实验材料,通过两相分配法提取根尖细胞高纯度质膜,并利用IEF/SDS-PAGE双向电泳和SDS-PAGE单向电泳对盐胁迫下质膜蛋白质组进行了比较研究,结合MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS质谱分析,鉴定了质膜蛋白质组中的胁迫响应蛋白；然后利用实时定量PCR对鉴定的蛋白质在转录水平的变化进行了分析；在此基础上,对其中一个LRR型受体蛋白激酶N末端片段进行原核表达,制备了该蛋白的多克隆抗体,通过免疫印迹（Western blot）、免疫组化（Immunohistochemistry）、免疫电镜（Immunoelectron microscopy）和免疫共沉淀（Immunoprecipitation）对该蛋白的功能进行了分析,主要内容如下：1.盐胁迫下水稻根尖质膜蛋白质组和相关转录组研究150mM NaCl处理水稻水培根尖发现盐胁迫48h显著抑制根的生长。取盐胁迫48h水稻根尖,利用葡聚糖-聚乙二醇两相分配法纯化得到纯度接近90%的质膜组分,IEF/SDS-PAGE双向电泳分析,发现34个蛋白点在盐处理后的表达有显著差异（>1.5倍）,其中16个蛋白点上调,18个蛋白点下调。MALDI-TOF/TOF质谱鉴定表明这些差异蛋白大多数是膜相关蛋白,涉及很多重要的生理过程：（1）膜稳定性,包括参与细胞和膜骨架形成的remorin;细胞壁骨架连接的肌球蛋白重链相关蛋白；参与跨膜物质运输的α-可溶性NSF附着蛋白等。（2）离子动态平衡,包括参与了液泡膜电化学梯度和离子运输的V-ATPase E亚基和putative YLP;参与钾离子通道控制的超敏诱导蛋白；调节质膜H+-ATPase活性和离子通道（K+外排）控制的14-3-3蛋白等。（3）信号转导,例如参与Ca2+信号转导途径的钙调素和DREPP蛋白；参与环境胁迫信号转导的LRR（Leucine Rich Repeat）型受体蛋白激酶等。为了分析质膜上多次跨膜蛋白,利用高盐（0.6 M KC1）和温和去污剂（15 mM CHAPS）对纯化的质膜进行洗涤,以降低质膜组分的复杂程度,然后通过SDS-PAGE单向电泳分离和LC-MS/MS质谱分析,鉴定了多个疏水性较强的多次跨膜蛋白：如参与细胞水分调控的水通道蛋白aquaporinPIP2.2,参与膜结构稳定性维持和膜运输的annexin,参与质膜跨膜电势形成和物质运输的H+-ATPase和参与囊泡运输的Rab11C等。在此基础上,利用实时荧光定量PCR对双向电泳和SDS-PAGE分离鉴定的部分蛋白进行转录水平的研究,发现有5种蛋白转录水平和蛋白水平变化一致（putative remorin 1 protein, putative receptor proteinkinase, hypersensitive-induced response protein,14-3-3 like protein和cytochrome b5），3种蛋白转录水平和蛋白水平变化不一致（Calmodulin, putative alpha-soluble NSF attachment protein和putative YLP）.研究结果表明高等植物中基因表达存在转录水平和翻译水平的差异,推测这种差异和mRNA、蛋白质各自的修饰及稳定性有关。2.水稻LRR型受体蛋白激酶胞外区的原核表达、抗体制备和生物功能分析上述组学研究发现了一个新的水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1。OsRPK1蛋白利用SMART软件分析其保守结构域,该蛋白含有一个跨膜域,N端存在信号肽,胞外区具有6个亮氨酸拉链富集区（LRR）; C端含有蛋白激酶保守结构域。OsRPK1和水稻OsRLK1、OsLRK1、OsBRI1、OsXa21、拟南芥AtRPK1、玉米ZmRLK和胡萝卜DcPSKR等植物中的LRR型受体蛋白激酶序列同源性分别25.31%、22.7%、21.3%、23.07%、22.68%、20.47%和25.05%。构建系统进化树分析表明OsRPK1和玉米中ZmRLK同源关系较近。为了进一步研究该激酶的生理功能,利用DNAStar Protean软件对水稻受体激酶OsRPK1勺抗原指数分布进行了分析,选择抗原性和特异性均较高的Aa 154-350片段作为抗原,通过反转录PCR得到cDNA片段,并亚克隆至pET29a原核表达载体,在大肠杆菌BL21中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%。重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化和Western blot检测,得到1：20000效价的多克隆抗体。该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型受体蛋白激酶。利用该制备抗体通过免疫电镜直接验证了OsRPK1的亚细胞定位是细胞质膜。通过western blot研究了盐、干旱、冷和ABA等非生物胁迫条件下OsRPK1的表达情况,发现盐胁迫12h OsRPK1的表达显著上调,至胁迫48h表达仍维持在较高的水平,OsRPK1免疫组化分析进一步证实了上述结果；干旱胁迫3h和12h OsRPK1的表达显著上调,48h后又恢复到正常水平；OsRPK1对冷不敏感,胁迫48h表达量只有轻微增加；ABA处理下,OsRPK1表达持续上升。研究结果表明,OsRPK1表达主要由渗透胁迫引起,因为在植物中盐胁迫和干旱胁迫比冷胁迫能更直接引起渗透胁迫；由于这三种胁迫都和ABA相关,所以外源ABA处理能快速引起OsRPK1表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语词汇表
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 植物对盐胁迫的反应及其抗盐机理研究进展
• 1 盐胁迫对植物的伤害
• 1.1 盐胁迫对植物细胞膜结构的破坏
• 1.2 盐胁迫对植物光合作用的影响
• 1.3 盐胁迫对植物呼吸作用的影响
• 1.4 盐胁迫对植物物质和能量代谢的影响
• 1.5 盐胁迫对植物内源激素的影响
• 2 植物抗盐机理研究
• 2.1 离子的选择性吸收、外排和区域化
• 2.2 相溶性溶质的合成和积累
• 2.3 盐胁迫信号转导途径
• 2.4 活性氧代谢
• 2.5 耐盐性的分子机制
• 2.6 光合作用路径的变化
• 3 展望
• 第二章 水稻蛋白质组学研究进展
• 1 蛋白质组学研究方法和步骤
• 1.1 蛋白质样品的制备
• 1.2 双向凝胶电泳
• 1.3 蛋白质点的检测
• 1.4 图像分析
• 1.5 质谱技术
• 2 水稻表达蛋白质组学研究进展
• 2.1 水稻组织器官中的蛋白质组研究
• 2.2 水稻亚细胞水平的蛋白质组研究
• 3 水稻功能蛋白质组学研究进展
• 3.1 水稻响应非生物胁迫的蛋白质组研究
• 3.2 水稻响应生物胁迫的蛋白质组研究
• 4 展望
• 第三章 水稻亮氨酸型类受体蛋白激酶的研究进展
• 1 LRR-RLKs的结构
• 1.1 胞外LRR域
• 1.2 胞内域
• 2 生物学功能
• 2.1 参与抗逆性反应
• 2.2 调节植物发育
• 2.3 介导植物激素的信号转导
• 3 介导信号转导的分子机制
• 3.1 复合物相互作用与信号识别
• 3.2 LRR型受体激酶下游成分
• 4 展望
• 第二篇 研究报告
• 第四章 盐胁迫下水稻根尖质膜蛋白质组和相关转录组研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与胁迫处理
• 1.2 主要仪器、试剂及耗材
• 1.3 耐盐性测定
• 1.4 细胞膜制备及纯化
• 1.5 质膜纯度鉴定
• 1.6 双向电泳蛋白样品制备
• 1.7 双向电泳及图像分析
• 1.8 MALDI-TOF/TOF质谱样品制备
• 1.9 肽质指纹图谱分析及数据库查询
• 1.10 SDS-PAGE样品制备、电泳和LC-ESI-MS/MS质谱鉴定
• +-ATPase水解活性的测定'>1.11 水稻根中过氧化物酶（POD）活性、MDA含量和H⁺-ATPase水解活性的测定
• 1.12 引物设计与合成
• 1.13 水稻总RNA的提取及痕量基因组DNA的去除
• 1.14 RT-PCR反应
• 1.15 PCR产物纯化
• 1.16 荧光实时定量PCR标准曲线的制定
• 2 实验结果
• 2.1 耐盐性测定
• 2.2 质膜纯化及纯度鉴定
• 2.3 盐胁迫下水稻根尖质膜蛋白的双向电泳分析
• 2.4 差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 2.5 SDS-PAGE质谱结果分析
• +-ATPase酶活性'>2.6 盐胁迫抑制了水稻根尖POD和质膜H⁺-ATPase酶活性
• 2.7 实时荧光定量PCR反应体系的建立
• 2.8 实时荧光定量PCR实验结果
• 3 讨论
• 3.1 Real time-PCR反应体系建立
• 3.2 膜稳定性
• 3.3 离子的动态平衡
• 3.4 信号转导
• 3.5 盐胁迫相关蛋白
• 3.6 功能未知的蛋白
• 3.7 mRNA和蛋白的不一致性
• 4 小结
• 第五章 水稻LRR型受体蛋白激酶胞外区的原核表达、抗体制备和生物功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 OsRPK1重组质粒构建和RPK1引物的设计与合成
• 1.5 OsRPK1基因的RT-PCR扩增
• 1.6 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 1.7 PCR产物的回收及T-A克隆
• 1.8 DH5α和BL21感受态细菌的制备
• 1.9 pMD18T-RPK1和pET29a质粒提取
• 1.10 目的基因片段和PET29a载体的双酶切
• 1.11 表达质粒pET29a与目的基因片段的连接
• 1.12 连接反应混合物转化DH5α
• 1.13 DH5 α菌中的重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定
• 1.14 重组质粒转化BL21细菌和鉴定
• 1.15 OsRPK1蛋白胞外区的原核表达
• 1.16 目的蛋白表达的可溶性检测
• 1.17 动物免疫及多克隆抗体的制备
• 1.18 水稻根尖细胞质和质膜蛋白的提取
• 1.19 Western印迹
• 1.20 免疫组织化学检测
• 1.21 免疫透射电镜检测
• 1.22 免疫沉淀（Immunoprecipitation）分析
• 2 实验结果
• 2.1 水稻质膜LRR型受体蛋白激酶OsRPK1序列分析
• 2.2 原核表达载体的构建
• 2.3 蛋白的诱导表达与纯化
• 2.4 抗体的特异性分析
• 2.5 水稻根尖OsRPK1在非生物胁迫下诱导表达
• 2.6 水稻根尖OsRPK1在盐、干旱、冷和ABA处理下免疫电镜分析
• 2.7 水稻根尖OsRPK1在盐和ABA胁迫下免疫沉淀分析
• 3 讨论
• 全文结论
• 创新之处
• 存在问题及工作展望
• 参考文献
• 附录
• 1. 木村B营养液配方
• 2. OSRPK1蛋白序列BLASTP分析
• 3. PET29A-RPK1重组子设计分析
• 4. PET29A-RPK1重组子测序结果
• 攻读博士学位期间发表与投送的论文
• 致谢