中国恒河猴Mamu-A*01基因筛选和功能研究及其与SIV/SHIV感染易感性分析

论文摘要

艾滋病的发生发展在患者中的表现存在程度不同的差异性,影响因素非常多,其中个体差异,即遗传背景中的一些基因可能参与影响疾病过程。Mamu-A*01是恒河猴中的一种MHC-I类分子,国外发现Mamu-A*01基因与感染SIV的印度恒河猴疾病进程有明显关联作用,本文以中国恒河猴为研究对象,进行Mamu-A*01基因与SIV/SHIV感染易感性的相关研究,目的为探讨Mamu-A*01基因在中国恒河猴中的分布及其在SIV/SHIV感染中的作用,可进一步加深对MHC在疫苗研究中作用的了解,为建立具有更高针对性、更适合评价我国艾滋病疫苗的SIV/SHIV/SAIDS动物模型奠定实验基础。本研究共选用128只中国恒河猴进行Mamu-A*01基因筛查,通过序列特异性引物PCR（PCR-SSP）方法扩增Mamu-A*01基因,克隆测序后与印度恒河猴的Mamu-A*01基因进行同源比对;ELISPOT方法分别检测Mamu-A*01基因阳性和阴性恒河猴针对SIV、SHIV抗原肽p11C的特异性CTL反应。对筛查出的Mamu-A*01基因阳性恒河猴观察在病毒载量、CD4+/CD8+比值以及CD4+T细胞绝对值中与Mamu-A*01基因阴性恒河猴的差别,以进一步探讨中国恒河猴Mamu-A*01基因在SIV/SHIV恒河猴模型中对病程的影响。同时,我们还对部分中国恒河猴的其他一些Mamu-I类分子的等位基因（Mamu-A*02、Mamu-A*04、Mamu-A*08、Mamu-A*13、Mamu-NA4、Mamu-NA7、Mamu-B*01、Mamu-B*07、Mamu-B*17）进行筛查,以期进一步推测各等位基因间的协同或拮抗作用。本实验共筛查出5只Mamu-A*01基因阳性恒河猴,序列分析显示与印度恒河猴的基因同源性可达99.1%,这5只均为SIV/SHIV感染恒河猴,其中四只SIV感染猴的ELISPOT结果显示针对p11C的高频CTL反应,斑点数在500-1400/10 PBMCs之间,而另1只SHIV感染的恒河猴及5只阴性猴没有斑点出现。对筛出的4只SIV感染的Mamu-A*01基因阳性恒河猴病毒载量、CD4+/CD8+比值以及CD4+T细胞绝对值进行回顾性研究发现,Mamu-A*01基因阳性恒河猴的CD4+/CD8+比值略高于Mamu-A*01基因阴性恒河猴,但比值均大于1.0,未出现明显的比例倒置现象,病毒载量及CD4+T细胞绝对值在两者之间的没有明显差别,因为此部分实验为一种回顾性研究,缺乏部分急性感染期资料,且可能受其他实验因素影响,故本部分实验结果仅供参考。实时荧光定量PCR技术因具有特异性强、自动化程度高、可有效解决PCR污染问题等特点而得到广泛应用。标准品的构建是实时荧光定量PCR实验中非常重要和关键的一步,它决定着实验结果的准确性和可靠性。依赖核酸序列的扩增（Nucleicacid sequence-based amplification,NASBA）主要用于RNA的扩增、检测及测序。该反应具有快速、敏感、特异性强等特征。本实验利用NASBA方法进行SIV/SHIV病毒RNA载量标准品的建立,以期找到一种方便快捷、简单实用的标准品建立方法。实验结果表明,我们成功建立了SIV/SHW病毒RNA载量测定的标准品,该RNA标准品具有较好的重复性和稳定性,因此可使用该标准品对SIV/SHIV病毒RNA进行定量。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 前言
• 第二部分 中国恒河猴Mamu-A*01基因筛查及其对抗原肽p11C的特异性CTL反应
• 第一节 引言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 结果
• 第四节 讨论
• 第三部分 中国恒河猴Mamu-A*01基因与SIV感染易感性的研究
• 第一节 引言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 结果
• 第四节 讨论
• 第四部分 SIV/SHIV RNA拷贝数测定标准品的制备——NASBA法
• 第一节 引言
• 第二节 材料和方法
• 第三节 结果
• 第四节 讨论
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 附录
• 发表论文
• 致谢