荧光假单胞菌2P24中RpoZ对抗生素合成基因及群体感应系统的调控作用

论文摘要

Pseudomonas fluorescens2P24是从小麦全蚀病的自然衰退土壤中分离出来的,它可以有效防治多种植物病原菌、细菌引起的土传病害。P. fluorescens2P24可产生多种次生代谢物,如抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-Diacetyphlorogulucinol,2.4-DAPG）、嗜铁素、蛋白酶和氢氰酸等,这些次生代谢物质在植物病害生物防治中起着重要作用,其中2,4-DAPG占其主要作用,它是一种广谱性抗生素。GacS/GacA双因子调控系统对于抗生素的合成、HCN以及胞外酶的产生有重要的调节的作用。PcoI/PcoR群体感应系统（Quorum Sensing, QS）在番茄青枯病与小麦全蚀病的生物防治方面发挥着重要的功能,并且参与小麦根部定殖与生物膜的形成。为深入地了解P.fluorescens2P24防治病害的机理,本研究利用遗传学方法对该菌产生的抗生素2,4-DAPG的合成以及该菌内的QS系统进行深入的研究。本研究以含有phlA-lacZ转录融合的报告质粒菌株PM901为出发菌株,利用Tn5转座子来筛选调控2,4-DAPG合成基因phlA表达的调控因子。从10,000株的突变体中,共筛选到21株突变菌株,经测定表明,突变菌株中phlA基因的表达与野生菌株相比明显不同,其中突变菌株Aa4-29phlA基因的表达明显降低,对其Tn5转座子的侧翼序列进行克隆后分析发现,突变菌株Aa4-29破坏了rpoZ基因,在很多细菌中是编码omiga亚基RpoZo本研究结果表明,在P.fluorescens2P24中,rpoZ对2,4-DAPG抗生素的合成基因phlA基因与PcoI/PcoR QS系统信号的合成基因pcol基因的表达在转录水平上有正调控作用,从而影响到2,4-DAPG抗生素与信号分子AHL的产生。rpoZ对于不翻译的小分子RNA的表达转录没有影响,但是却对RsmA蛋白的表达有影响,另外对rpoS基因也有一定地调控作用。温室生物测定试验表明,利用rpoZ基因缺失菌株防治棉花立枯丝核菌,结果rpoZ基因缺失菌株相对于野生菌株2P24防治能力显著下降,这说明rpoZ基因参与调控菌株P.fluorescens2P24的生防能力。在菌株2P24中,QS系统参与根围的定殖、生物膜的形成等,rpoZ基因正调控QS系统,所以rpoZ是通过QS系统影响根围的定殖能力、生物膜的形成而影响生防能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 假单胞菌国内外的研究进展
• 1.2 荧光假单胞菌生防机制的研究
• 1.2.1 诱导抗性
• 1.2.2 竞争作用
• 1.2.3 溶菌作用
• 1.2.4 定殖作用
• 1.2.5 抗生素及2,4-二乙酰基间苯三酚
• 1.3 荧光假单胞菌的调控作用
• 1.3.1 转录水平上对次生代谢物质的调控作用
• 1.3.2 转录后水平上对次生代谢物质的调控作用
• 1.4 RNA聚合酶中ω亚基的研究进展
• 1.4.1 ω亚基的发现及鉴定
• 1.4.2 ω亚基的功能
• 1.4.3 结论与未来的发展前景
• 1.4.4 研究目的与意义
• 1.5 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株、质粒与培养条件
• 2.2 培养基和常用的缓冲液
• 2.3 基本的分子操作
• 2.3.1 DNA提取的操作方法
• 2.3.2 质粒的纯化
• 2.3.3 质粒的酶切
• 2.3.4 连接
• 2.3.5 E.coli DH5 α感受态细胞的小剂量制备
• 2.3.6 质粒的热击转化
• 2.3.7 质粒的电击转化
• 2.4 方法
• 2.4.1 Tn5转座子诱变以及突变体的筛选
• 2.4.2 β-半乳糖苷酶活性测定
• 2.4.3 对突变子侧翼序列的克隆
• 2.4.4 rpoZ基因缺失突变菌株与互补菌株的构建
• 2.4.5 PM901及其衍生菌phlA::lacZ活力的水平检测
• 2.4.6 2P24及其衍生菌株生长曲线测定方法
• 2.4.7 2P24及其衍生菌株的QS信号分子（AHL）合成能力的检测
• 2.4.8 2P24及其衍生菌株的生防相关性状的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 P.fluorecens 2P24菌株中rpoZ基因的克隆及其特征的分析
• 3.2 rpoZ基因对抗生素合成基因phlA的转录及对2,4-DAPG产量的影响
• 3.3 rpoZ基因对生长速率的影响
• 3.4 rpoZ基因对信号合成基因pcoI的转录及对信号分子AHL产量的影响
• 3.5 rpoZ基因对小RNA分子的转录调控的影响
• 3.6 rpoZ基因对小蛋白的转录调控的影响
• 3.7 rpoZ对其他基因的调控与表达
• 3.7.1 rpoZ对phlF基因的调控
• 3.7.2 rpoZ对rpoS基因的调控sigma因子
• 3.7.3 rpoZ对多重耐药泵基因的调控
• 3.8 rpoZ基因生防相关性状的检测
• 3.9 rpoZ对生物膜形成的影响
• 3.10 rpoZ基因突变对小麦根部定殖的影响
• 3.11 rpoZ以基因的突变对棉花猝倒病防治的影响
• 4 结论与讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介