桑树内生菌Micrococcus luteus-Y2发酵产DNJ的研究

论文摘要

1-脱氧野尻霉素（DNJ）是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,能有效抑制糖吸收,降低血糖值。桑根皮在中国古代就被用作治疗“消渴症”的良药。现代科学已经证明,桑树中降血糖的主要有效成分是DNJ。鉴于此,前人已经对不同桑品种、桑树不同部位、不同叶位、不同季节、不同产地、甚至多种食桑昆虫的DNJ含量进行了研究,但是桑树体内DNJ的来源尚未有明确的研究结果。目前,从中药材中提取以及利用植物内生菌获得具有疗效的活性物质成为药物研究的重要方向。本实验室在前期试验中已经从桑树中分离到两株产DNJ的内生菌:嗜麦芽寡养假单孢杆菌（Stenotrophomonas maltophilia）Y1和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）Y2。本文对Y2菌株的生理生化指标和生物学特性进行了测定;研究了Y2菌株产DNJ的最佳发酵条件和发酵配方,并对发酵产物进行了初步分离提纯;建立了体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定模型,测定了Y1和Y2发酵产物粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。同时,为探讨桑树中的DNJ来源,本试验还测定了桑树无菌苗的DNJ含量。主要研究结果如下:1测定了Y2菌株的生理生化指标和生物学特性,结果表明Y2与藤黄微球菌的鉴定特征相符。Y2菌株接种后36 h为对数生长期,36 h60 h是生长稳定期,60 h后开始衰老;菌株适宜生长的温度是25℃35℃,可耐受最低生长温度为4℃,最高为40℃,最适生长温度为30℃;该菌株较适宜的pH范围是6.58.0,其中最适宜的pH是7.0,适宜在中性偏碱性条件下生长,并有较强的耐盐性。2通过摇瓶培养方法,探讨了环境条件和培养基组分对Y2菌株产DNJ的影响。利用单次单因子试验确定了摇瓶发酵的最佳条件为:接种量2%（v/v）、摇瓶装液量50 mL/250 mL、发酵温度30℃、初始pH 7.0,发酵时间30 h。在此基础上通过单次单因子试验确定了摇瓶发酵配方的最佳碳源、氮源、无机盐组合。运用PB部分因子试验分析了培养基组分:蛋白胨、麦芽糖、MgSO4、KH2PO4、NaCl对Y2菌株产DNJ的影响。结果表明,蛋白胨对Y2菌株发酵产DNJ的影响达到极显著水平,KH2PO4对Y2菌株发酵产DNJ的影响达显著水平,而麦芽糖、MgSO4、NaCl对Y2菌株发酵产DNJ的影响不显著。通过最陡爬坡路径试验逼近最大响应区域,最后用中心组合设计和响应面分析,确定了主要影响因子的最佳浓度。最优化培养基为:麦芽糖20.00 g、蛋白胨36.53 g、KH2PO4 2.22 g、MgSO4 0.5 g、NaCl 4 g、去离子水1000 mL。运用最佳发酵培养基和最佳发酵条件进行摇瓶发酵,利用RP-HPLC-UV法测得发酵液中DNJ的浓度达到了213.18μg/ml,较基础培养基DNJ浓度值提高了184.63%。3对Y2菌株产生的DNJ进行了初步分离纯化。Y2菌株发酵样品进行浓缩后,又经过乙醇沉淀、过NKA-9型大孔吸附树脂和强酸型离子交换树脂,最后的样品经过浓缩、冷冻干燥成样品。提取物衍生化后利用RP-HPLC-UV法对样品进行检测,结果显示,该纯化工艺去除了大量杂质,色谱图中的杂峰大大减少,DNJ含量达到了0.337%,较之前提高了5.3倍。4通过体外α-葡萄糖苷酶抑制模型测定了Y1、Y2菌株发酵液提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明:两种内生菌发酵分离物都具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,且最终抑制活性均高于对照药物阿卡波糖,菌株Y2发酵液提取物的抑制中浓度为111.58 mg/L,菌株Y1发酵液提取物的抑制中浓度为2307.56 mg/L,分离物的抑制活性均与浓度呈正相关,其抑制活性具有剂量依赖性。5检测了桑树无菌苗的DNJ含量。运用细菌培养基和真菌培养基对桑树无菌苗内的内生菌检测培养,平板中没有杂菌生长,推断桑树组培苗脱毒成功,已无内生菌在其体内共生。桑树无菌组培苗干物中DNJ含量检测结果为0.197%,与大田中的桑树DNJ含量相当,证明桑树体内的DNJ不只依赖桑树内生菌的产生,桑树本身亦可合成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 DNJ 的性质
• 1.2 天然DNJ 的来源
• 1.2.1 植物来源
• 1.2.2 微生物来源
• 1.2.3 昆虫来源
• 1.3 DNJ 在生物体内的合成途径
• 1.4 DNJ 的人工合成
• 1.4.1 以L-山梨糖或 D-葡萄糖为起始原料的化学合成法
• 1.4.2 以非葡萄糖、非山梨糖为原料的化学合成法
• 1.4.3 微生物转化与化学合成相结合制备DNJ
• 1.5 DNJ 的药用价值
• 1.5.1 降血糖作用
• 1.5.2 抗肿瘤作用
• 1.5.3 抗病毒作用
• 1.6 DNJ 的提取与分离纯化
• 1.6.1 浸提萃取法
• 1.6.2 超声提取法
• 1.6.3 微波提取法
• 1.6.4 酶解提取法
• 1.6.5 树脂吸附法
• 1.7 糖苷酶抑制剂的研究概况
• 1.7.1 α-葡萄糖苷酶抑制作用机理
• 1.7.2 目前临床应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物
• 1.7.3 天然中药材中α-糖苷酶抑制剂的研究进展
• 1.7.4 α-糖苷酶抑制剂活性的测定方法
• 1.8 微生物发酵优化研究概况
• 1.8.1 发酵概况
• 1.8.2 数理统计方法在微生物发酵工艺优化中的应用
• 1.9 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试生物材料
• 2.1.2 培养基及缓冲液
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 Y2 菌株的培养
• 2.2.2 Y2 菌株生理生化指标测定方法
• 2.2.2.1 菌株的生长环境试验
• 2.2.2.2 菌株对生物大分子的水解试验
• 2.2.2.3 菌株对含碳化合物的代谢试验
• 2.2.2.4 菌株对含氮化合物的代谢试验
• 2.2.2.5 菌株的呼吸作用试验
• 2.2.2.6 菌株其他生化指标测定
• 2.2.2.7 菌株生物学特性测定
• 2.2.3 DNJ 的测定
• 2.2.3.1 DNJ 标准液的配制
• 2.2.3.2 发酵液中DNJ 的提取
• 2.2.3.3 DNJ 提取物的样品制备
• 2.2.3.4 桑树组培苗样品的制备
• 2.2.3.5 DNJ 的衍生化处理
• 2.2.3.6 DNJ 的测定方法
• 2.2.4 Y2 菌株产DNJ 发酵条件的筛选
• 2.2.4.1 不同发酵温度对DNJ 产量的影响
• 2.2.4.2 不同发酵液初始pH 对DNJ 产量的影响
• 2.2.4.3 不同接种量对DNJ 产量的影响
• 2.2.4.4 不同装液量对DNJ 产量的影响
• 2.2.4.5 DNJ 的产生曲线的测定
• 2.2.5 Y2 菌株产DNJ 发酵培养基的优化
• 2.2.5.1 发酵培养基单因素发酵优化
• 2.2.5.2 Plackett-Burman（PB）试验设计
• 2.2.5.3 最陡爬坡试验
• 2.2.5.4 中心组合试验
• 2.2.6 Y2 菌株发酵液中DNJ 的分离纯化
• 2.2.6.1 Y2 菌株发酵液的预处理
• 2.2.6.2 Y2 菌株发酵液的大孔吸附树脂分离
• 2.2.6.3 DNJ 粗品的离子交换树脂分离
• 2.2.7 菌株发酵液分离物的糖苷酶抑制活性测定
• 2.2.7.1 供试样品的制备
• 2.2.7.2 供试样品溶液的配置
• 2.2.7.3 鼠肠α-葡萄糖苷酶的制备
• 2.2.7.4 标准曲线的制作
• 2.2.7.5 α-葡萄糖苷酶活力的测定
• 2.2.7.6 精密度试验
• 2.2.7.7 重复性试验
• 2.2.7.8 试验样品α-葡萄糖苷酶抑制作用检测
• 2.2.8 桑树组培苗的无菌检测
• 3 结果与分析
• 3.1 Y2 菌株的生理生化和生物学特性
• 3.1.1 Y2 菌株的生理生化特性
• 3.1.2 Y2 菌株的生物学特性
• 3.1.2.1 Y2 菌株的生长曲线
• 3.1.2.2 温度对Y2 菌株生长的影响
• 3.1.2.3 pH 对Y2 菌株生长的影响
• 3.2 Y2 菌株产DNJ 发酵条件和发酵培养基的优化
• 3.2.1 Y2 菌株产DNJ 发酵条件的筛选
• 3.2.1.1 不同发酵温度对DNJ 产量的影响
• 3.2.1.2 不同发酵液初始pH 对DNJ 产量的影响
• 3.2.1.3 不同接种量对DNJ 产量的影响
• 3.2.1.4 不同装液量对DNJ 产量的影响
• 3.2.1.5 DNJ 产生曲线测定结果
• 3.2.2 Y2 菌株产DNJ 发酵培养基的优化
• 3.2.2.1 Y2 菌株产DNJ 发酵培养基单因素优化
• 3.2.2.2 Plackett-Beuman 试验结果
• 3.2.2.3 最陡爬坡试验结果
• 3.2.2.4 中心组合试验
• 3.3 Y2 菌株发酵液中DNJ 的初步分离纯化
• 3.3.1 大孔吸附树脂对DNJ 的吸附解吸性能比较
• 3.3.2 Y2 菌株发酵液DNJ 分离纯化效果
• 3.4 Y1 和Y2 菌株发酵液分离物对糖苷酶的抑制作用
• 3.4.1 发酵液提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用与剂量关系
• 3.4.2 菌株发酵液提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性
• 3.5 桑树无菌苗中DNJ 检测
• 3.5.1 桑树组培苗的无菌检测结果
• 3.5.2 桑树无菌苗DNJ 测定结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录 SAS 分析源程序
• 致谢
• 攻读硕士研究生期间公开发表的论文
• 硕士学位论文内容简介及自评