内参基因的筛选及嗜酸氧化亚铁硫杆菌NRAMP家族基因的mRNA转录水平的研究

论文摘要

嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A cidithiobacillus ferrooxidans; At. ferrooxidans）是生物冶金工业中十分重要的一种细菌。它是一种嗜酸的,需氧的,化能自养的,γ型蛋白质细菌,它的能量来源是通过氧化亚铁或氧化还原性无机硫,最适pH为1.8—2.2。NRAMP （natural resistance-associated macrophage protein）家族的功能是转运金属离子,从细菌到人都发现NRAMP的存在。在At. ferrooxidans中,有两个NRAMP成员,它们是AFE2126和AFE2920。本文首先通过测序At. ferrooxidans DC和At. ferrooxidans DY15两株菌的AFE2126和AFE2920基因,通过序列比对发现At. ferrooxidans DC的AFE2126基因与标准菌At. ferrooxidans ATCC23270的AFE2126基因序列完全相同,而At. ferrooxidans DY15菌的AFE2126基因序列与标准菌At. ferrooxidans ATCC23270菌的AFE2126基因序列相比,有7处碱基位点发生了突变,但由于氨基酸的简并性,只有一个氨基酸位点发生了突变（T48）,由苏氨酸（T48,At. ferrooxidans DC）突变成蛋氨酸（M48, At. ferrooxidans DY15）; At. ferrooxidans DC的AFE2920基因与标准菌At. ferrooxidans ATCC23270的AFE2920基因序列完全相同,At. ferrooxidans DY15的AFE2920基因序列与标准菌At. ferrooxidans ATCC23270的AFE2920基因序列相比有12处发生了突变,但由于氨基酸的简并性,只有一个氨基酸位点发生了突变（A343）,丙氨酸（A343, At. ferrooxidans DC）突变成缬氨酸（V 343, At. ferrooxidans DY15）。通过蛋白质亚细胞定位（PSORTb v2.0 server）,得知At. ferrooxidans DC和At. ferrooxidans DY15的AFE2126和AFE2920蛋白质均位于细胞质膜上；通过跨膜分析（TMHMM v2.0 server）,得知AFE2126和AFE2920蛋白质均跨膜11次。通过转运基序分析（Motif Scan server）得知At. ferrooxidans DC和At. ferrooxidans DY15的AFE2126和AFE2920的NRAMP保守转运基序分别为5’-QVIASIFMPAAMLFLLMLLNDREIMGSYVNRR-3’和5’-IITAAQSGAQWGFKLLLLQFVLMPILYIVQELTVRLGIFTGK-3’。通过PCR和测序得到At. ferrooxidans DC的7个候选内参基因的序列和大小为AFE2121（map,810 bp）, AFE2475（gmk,639 bp）, AFE2714 （rplL,387 bp）, AFE2150（gyrA,2538 bp）,AFE2114（recA,1038 bp）, AFE1680（era,915 bp）, AFE2711（rpoC,4155 bp）。通过序列比对发现,这7条序列与标准菌At.ferrooxidans ATCC23270的AFE2121（map）, AFE2475（gmk）, AFE2714（rplL）, AFE2150 （gyrA）, AFE2114（recA）, AFE1680（era）, AFE2711(rpoC的序列完全相同。用RT-qPCR （the Reverse Transcription fluorescence-based quantitative real-time PCR）分析了At. ferrooxidans DC菌在6个不同培养条件下的7个候选内参基因的转录水平,用geNorm评估了7个候选内参基因mRNA的转录稳定性,转录稳定的顺序由大到小是era, gmk, rpoC, gyrA,recA, map, rplL。选择mRNA转录最稳定的3个基因（era,gmk, rpoC）作为目标基因的内参基因,研究了At. ferrooxidans DC目标基因AFE2126和AFE2920基因的mRNA在不同亚铁离子的浓度下的转录水平,表明随着亚铁离子浓度的增加,基因AFE2126的转录水平降低,但是AFE2920基因转录水平没有明显变化趋势。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物冶金
• 1.1.1 生物冶金简介
• 1.1.2 生物冶金机理
• 1.1.3 生物冶金浸矿细菌简介
• 1.2 金属离子转运载体NRAMP家族
• 1.2.1 二价金属阳离子的作用
• 1.2.2 NRAMP家族简介
• 1.3 RT-qPCR
• 1.3.1 RT-qPCR基本原理
• 1.3.2 检测系统及荧光染料
• 1.3.3 内参基因的确定
• 1.3.4 qPCR技术的应用
• 1.4 课题研究目的和研究内容
• 1.4.1 依据和目的
• 1.4.2 论文课题受资助情况
• 1.4.3 论文的主要研究内容
• 2126基因和AFE₂920基因的测序及分析'>第二章 At.ferrooxidans DC和DY15菌AFE₂126基因和AFE₂920基因的测序及分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 菌株和生长条件
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 细菌基因组的提取
• 2.2.4 PCR和测序
• 2.2.5 生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PCR扩增产物鉴定
• 2126'>2.3.2 At.ferrooxidans DC菌的AFE₂126
• 2920'>2.3.3 At.ferrooxidans DC菌的AFE₂920
• 2126'>2.3.4 At.ferrooxidans DY15菌的AFE₂126
• 2920'>2.3.5 At.ferrooxidans DY15菌的AFE₂920
• 2.3.6 AFE 2126基因比对
• 2920基因比对'>2.3.7 AFE₂920基因比对
• 2.3.8 NRAMP功能保守位点预测
• 2.4 本章小结
• 第三章 候选内参基因的测序及分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 菌株和生长条件
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 细菌基因组的提取
• 3.2.4 PCR和测序
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 候选内参基因的性质描述
• 3.3.2 候选基因测序结果及序列比对
• 3.4 本章小结
• 第四章 内参基因的评估和筛选
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 菌株和生长条件
• 4.2.2 接种和收菌
• 4.2.3 实时荧光定量PCR引物设计
• 4.2.4 总RNA的提取
• 4.2.5 RNA的完整性及浓度检测
• 4.2.6 cDNA合成
• 4.2.7 标准曲线样品的制备
• 4.2.8 实时荧光定量PCR（qPCR）
• 4.2.9 内参基因的筛选方法
• 4.3 结果与分析
• 2+)浓度范围的选择'>4.3.1 亚铁离子(Fe²⁺)浓度范围的选择
• 4.3.2 RNA完整性和质量评估
• 4.3.3 候选内参基因的熔解曲线和标准曲线
• 4.3.4 内参基因的评估和筛选
• 4.4 本章小结
• 第五章 At.ferrooxidans DC菌NRAMP家族基因的转录分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株和培养条件
• 5.2.2 接种和收菌
• 5.2.3 引物的设计与检测
• 5.2.4 总RNA的提取
• 5.2.5 RNA的完整性及浓度检测
• 5.2.6 cDNA合成
• 5.2.7 标准曲线样品的制备
• 5.2.8 实时荧光定量PCR（qPCR）
• 5.2.9 目标基因相对定量分析方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 目标基因的熔解曲线和标准曲线
• 5.3.2 目标基因转录水平分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果
• 科研情况