论文摘要
脓毒症（Sepsis）是严重创伤、烧伤、休克、外科大手术后常见的并发症,进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（Multiple Organ dysfanction Syndrome, MODS）等,已成为临床危重患者的重要死亡原因之一。据报道,临床危重病人中约有25%发展为脓毒症,10%-15%发展为严重脓毒症或脓毒症性休克。近年的临床研究证实,革兰阴性菌感染引起的内毒素（Lipopolysaccharides, LPS）释放是导致脓毒症的重要因素。资料表明,LPS通过与单核巨噬细胞膜上的Toll样受体4（Toll-Like Receptor 4, TLR4）结合将信号转入胞内,导致细胞活化、释放各种炎症介质,如：TNF-α、IL-1β和IL-6,这些细胞因子进而作为内源性介质,通过旁分泌或体循环远程分泌到达靶组织和靶细胞部位进而发挥生物学效应,引起全身性炎症反应。因而,巨噬细胞在LPS介导的脓毒症中发挥重要作用,深入研究脓毒症中巨噬细胞的活化及调控机制具有重要意义。T细胞免疫球蛋白粘蛋白（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein,Tim）基因家族是2001年在对哮喘的研究中发现的一个新基因家族,定位于小鼠染色体11B1.1,该区域与多种疾病的发生有密切的关系,如哮喘、过敏反应和自身免疫性疾病。小鼠Tim家族有8个基因,分别编码蛋白Tim-1-4和4个假想蛋白Tim-5～8。不同于其它的Tim分子,Tim-4并不表达在T细胞表面,而是选择性表达于抗原提呈细胞（Antigen presenting cells, APCs）,特别是髓系来源的树突状细胞和巨噬细胞表面。研究表明,Tim-4是另一家族成员Tim-1的配体,二者相互作用,可向T细胞传导活化或抑制信号,调节T细胞介导的免疫应答。新近研究表明,Tim-4可以作为磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine;PtdSer; PS）的受体,通过与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合,促进对凋亡细胞的吞噬。吞噬凋亡细胞是巨噬细胞的重要功能,Tim-4作为PS受体,参与巨噬细胞吞噬凋亡细胞,提示Tim-4分子可能参与调节巨噬细胞功能,从而可能参与脓毒症的发生发展。为了明确Tim-4分子是否参与巨噬细胞的调节,本课题组前期以巨噬细胞系RAW264.7为研究模型,研究发现,Tim-4可通过下调共刺激分子CD80、CD86及MHCII类的表达负性调节小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学活性。此外,利用刀豆蛋白A（Concanavalin A,ConA）诱导小鼠急性肝损伤模型,研究发现,将稳定过表达Tim-4的小鼠巨噬细胞系RAW264.7-Tim-4回输到小鼠体内可以减轻ConA诱发的小鼠急性肝损伤,初步提示Tim-4负性调节巨噬细胞系RAW264.7的功能。然而,Tim-4对巨噬细胞的调节作用尚需在多种细胞体系中进行验证。此外,Tim-4调控巨噬细胞的通路是什么,Tim-4介导的巨噬细胞调控是否与巨噬细胞相关疾病发生相关,迄今尚未报道。本论文首先研究Tim-4介导的巨噬细胞调控在脓毒症中的作用,进而利用小鼠巨噬细胞系RAW254.7及小鼠腹腔巨噬细胞为模型,体外探讨Tim-4对LPS/TLR4介导的巨噬细胞活化的调控作用及分子机制,在此基础上研究Tim-4对poly（I：C）及IFN-γ介导的巨噬细胞活化的调节作用,为深入阐明脓毒症的发病机制和Tim-4在固有免疫中的作用提供实验依据,并为脓毒症的治疗提供新的靶点。一、Tim-4负性调节LPS介导的小鼠巨噬细胞活化,抑制LPS介导的小鼠脓毒症LPS/TLR4介导巨噬细胞活化并释放多种效应分子是巨噬细胞发挥功能的重要基础,大量LPS释放介导巨噬细胞过度活化导致脓毒血症,是临床常见并发症。本课题首先研究Tim-4对LPS/TLR4介导巨噬细胞活化的调控作用及机制,并探讨Tim-4介导的巨噬细胞活化在脓毒症中的作用。（一）体内实验表明,Tim-4抑制LPS介导的小鼠脓毒症在LPS诱导的脓毒症模型中,LPS首先激活巨噬细胞合成和释放各种细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6,这些细胞因子以受体介导的作用方式发挥生物学效应,进而引起全身性炎症反应。因而,巨噬细胞的激活在LPS诱导的脓毒症模型中居于核心地位。为此,本论文以LPS诱导的脓毒症为模型,研究Tim-4在体内对巨噬细胞的调控作用。1.LPS诱导的脓毒症小鼠中Tim-4 mRNA表达升高BALB/c小鼠腹腔注射15mg/kg LPS建立脓毒症模型,8h后,取各脏器,RT-PCR检测Tim-4 mRNA表达。结果显示,相对于对照小鼠,脓毒症小鼠中骨髓来源巨噬细胞、脾脏和肺组织中Tim-4 mRNA的表达升高（p<0.05）,但脓毒症小鼠中肾脏Tim-4 mRNA的表达未见上调。2.聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）携载体内转染方法的建立为研究Tim-4在LPS介导脓毒症中的作用,我们设计在体内进行Tim-4过表达或Tim-4shRNA抑制。本论文采用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）携载质粒后进行尾静脉注射,建立有效的体内基因转染方法。为验证该方法的体内转染效率,本实验首先将表达绿色荧光的pEGFP-N1质粒与转染试剂PEI混合后（PEI携载）尾静脉输入小鼠体内,不同时间点后取组织,切片后荧光显微镜观察。结果显示,注射pEGFP-N1质粒2天和5天的脾脏均有较强绿色荧光,说明PEI携载可有效将pEGFP-N1质粒转染入小鼠体内并在体内表达目的基因。3.Tim-4过表达明显减缓LPS诱导的小鼠脓毒症为进一步验证Tim-4对脓毒症的影响,我们构建了pEGFP-N1-Tim-4表达载体。PEI携载后尾静脉注射,3天后处死小鼠,取肝、脾、肺和肾,抽提RNA。RT-PCR检测结果显示,注射pEGFP-N1-Tim-4质粒的小鼠,肝、脾、肺和肾中Tim-4表达升高,说明pEGFP-N1-Tim-4质粒成功输入小鼠体内并表达。BALB/c小鼠尾静脉注射PEI携载的60μg pEGFP-N1-Tim-4（pEGFP-N1质粒为对照）质粒,24h后腹腔注射15mg/kg LPS诱导脓毒症,同上观察生存率并检测血清细胞因子表达。结果表明,与对照pEGFP-N1质粒处理组相比,转染pEGFP-N1-Tim-4质粒小鼠生存率显著升高（n=10,p<0.05）,并且死亡时间推迟,且细胞因子TNF-α和IL-6的分泌下调（TNF-α:1.808±0.104ng/mL vs1.46±0.071ng/mL;IL-6:42.9±4.315 ng/mL vs 27.7±4.326 ng/mL,n=6,p<0.05）,提示Tim-4过表达可减缓LPS诱导的脓毒症。4. shRNA抑制Tim-4表达,显著加剧LPS诱导的小鼠脓毒症构建Tim-4 shRNA表达质粒,PEI携载后尾静脉注射BALB/c小鼠,3天后处死小鼠,抽提组织RNA。RT-PCR结果显示,Tim-4 shRNA质粒转输组小鼠脾脏及肺脏Tim-4 mRNA表达降低,提示构建的shRNA在体内能有效抑制Tim-4表达。Tim-4 shRNA表达质粒预处理BALB/c小鼠24h后,腹腔注射15mg/kg LPS诱导脓毒症,LPS注射12h后收集血清用于细胞因子测定,并观察小鼠生存率。结果表明,与转输对照Control shRNA质粒组相比,转染Tim-4 shRNA质粒小鼠生存率显著降低（n=10,p<0.05）。ELISA分析显示,与对照组相比,转输Tim-4 shRNA质粒小鼠细胞因子TNF-α和IL-6的分泌增加（TNF-a:1.64±0.077ng/mL vs 2.102±0.16ng/mL;IL-6:27±5.657 ng/mL vs 49±7.434 ng/mL, n=6,p<0.05）。上述体内过表达及shRNA抑制实验结果显示,Tim-4在LPS介导的小鼠脓毒症中发挥重要保护作用。（二） Tim-4对LPS介导的巨噬细胞活化的调节作用及分子机制LPS是巨噬细胞活化的强激活剂,可引起细胞因子合成和释放,导致全身性炎症反应发生。为了进一步研究Tim-4对巨噬细胞的调控作用,本研究首先检测了活化状态下巨噬细胞Tim-4的表达。1.LPS刺激促进体外培养小鼠巨噬细胞中Tim-4的表达分别以0、10、50和100ng/mL为终浓度的LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7 24 h,RT-PCR结果显示,LPS刺激可以促进Tim-4 mRNA表达,相对于未刺激组,LPS刺激组细胞Tim-4 mRNA表达逐渐上调,呈现剂量依赖性。此外,以100ng/mL LPS刺激RAW264.7,随时间延长（6h、12h和24h）Tim-4 mRNA的表达逐渐升高,并在24h达到高峰。Western Blot检测上述处理组细胞中Tim-4蛋白表达,得到了相同的结果。以上结果显示,小鼠巨噬细胞系RAW264.7经LPS活化后Tim-4表达上调且呈剂量及时间依赖性。为验证上述结果,我们利用小鼠腹腔巨噬细胞重复上述实验,RT-PCR结果显示,小鼠腹腔巨噬细胞经LPS活化后Tim-4 mRNA表达上调且呈剂量及时间依赖性。2.Tim-4抑制LPS介导的小鼠巨噬细胞NO及细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-β）分泌为了研究Tim-4对LPS/TLR4介导的小鼠巨噬细胞活化的调节作用,本研究利用Tim-4过表达、Tim-4 shRNA及Tim-4阻断型抗体预处理（阻断Tim-4通路）三种方法,分别从正反两方面研究Tim-4对LPS/TLR4介导巨噬细胞分泌NO和细胞因子功能的影响。2.1 Tim-4过表达明显抑制LPS介导的小鼠巨噬细胞NO及细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6、IFN-β）的产生利用本课题组前期筛选获得的稳定表达小鼠Tim-4的巨噬细胞系RAW264.7-pcDNA3-Tim-4为研究对象,Griess法检测结果显示,LPS刺激24h后,Tim-4稳定表达巨噬细胞NO的分泌明显低于对照细胞（37.47±1.129μM vs 43.37±1.66μM,p<0.05）。Western Blot检测显示,经LPS刺激12h,稳定表达Tim-4巨噬细胞iNOS蛋白表达亦低于对照细胞系。为了进一步验证上述结果,分别将不同剂量（0.2ug、0.6μg及1μg）pcDNA3-Tim-4及pcDNA3表达载体质粒转染小鼠腹腔巨噬细胞。Griess法检测显示,随着pcDNA3-Tim-4转染剂量的增加,LPS介导的巨噬细胞NO分泌明显降低,LPS刺激24h,0.6 u g及1μgpcDNA3-Tim-4转染组细胞NO分泌量分别为17±2.3μM、14.79+1.5μM,较对照组细胞（20.05±1.2μM,20.38±0.67μM）明显下调（p<0.05）。ELISA检测结果显示,随着pcDNA3-Tim-4转染剂量的增加,LPS介导的巨噬细胞细胞因子分泌显著降低：与对照组比较,LPS刺激6h后,转染0.6μgpcDNA3-Tim-4的巨噬细胞分泌IL-6的量显著降低（515.0±36.10pg/mL vs 661.0±29.51 pg/mL,p<0.05）;而转染1μgpcDNA3-Tim-4细胞产生TNF-α分泌（1960±88.64pg/mL vs 2639±127pg/mL,p<0.05）及IL-6的水平（460.3±27.48 pg/mL vs 610.3±21.31 pg/mL,p<0.05）均明显下调。转染不同剂量pcDNA3-Tim-4后巨噬细胞产生工L-1β和工L-10的水平与对照组无显著性差异。Real-Time PCR检测结果显示,lμgpcDNA3-Tim-4转染组细胞与对照pcDNA3组细胞相比,细胞因子IFN-βmRNA的表达下调。2.2.shRNA抑制Tim-4表达,促进LPS介导的小鼠腹腔巨噬细胞NO及细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的分泌以不同剂量的Tim-4 shRNA转染小鼠腹腔巨噬细胞48h,LPS刺激后分别在6h、24h收集上清,Griess法检测NO,ELISA检测细胞因子表达。结果显示,与对照shRNA组细胞相比,1μg Tim-4 shRNA转染组细胞NO分泌上调；0.6μg Tim-4 shRNA转染组细胞IL-6的分泌增加（641.7±40.83pg/mL vs 504.3±13.86pg/mL,p<0.05）;1μg Tim-4 shRNA转染组细胞TNF-α、IL-1β及IL-6分泌均升高（TNF-α:2514±174.7pg/mL vs 1962±74.54pg/mL,p<0.05,IL-1β:1247±53.39 pg/mL vs 845.3±66.03 pg/mL;IL-6:785.3±29.21 vs 477.7±29.19,p<0.005）。IL-10的分泌无统计学差异。2.3 Tim-4阻断型抗体显著促进LPS介导的小鼠巨噬细胞NO及细胞因子（TNF-α、IL-1β、和IL-6和IFN-β）的产生以不同浓度（终浓度为1μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL）的Tim-4阻断型抗体预处理小鼠腹腔巨噬细胞1h后,LPS刺激不同时间,同上检测NO及细胞因子的表达。结果显示,终浓度为5μg/mL Tim-4抗体处理组NO的分泌高于IgG对照组（37.43±0.81μM vs 32.73±0.98μM,p<0.05）。Western Blot检测显示5μg/mL Tim-4抗体阻断组细胞iNOS蛋白表达明显上调,与上述NO结果相符。ELISA检测结果显示,5μg/mL Tim-4抗体处理组细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌均明显高于IgG对照组（TNF-α:4032±42.7 pg/mL vs 3589±118.3 pg/mL;IL-1β:901±20.8 pg/mL vs 759±44 pg/mL;IL-6:664±25 vs 530±23.1,p<0.05）,而IL-10的分泌无统计学差异。Real-Time PCR检测结果显示,5μg/mL Tim-4抗体组IFN-βmRNA的表达明显高于IgG对照组（p<0.05）。以上研究结果提示,Tim-4基因沉默或功能阻断可促进小鼠巨噬细胞NO及细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及IFN-β的产生。综合上述结果,当小鼠巨噬细胞受到LPS刺激活化时Tim-4表达上调,上调的Tim-4抑制LPS活化的小鼠巨噬细胞产生NO及细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β）,提示Tim-4抑制LPS介导的巨噬细胞活化。3.Tim-4抑制LPS介导巨噬细胞活化的分子机制研究LPS作为TLR4的配体通过MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径介导巨噬细胞活化并产生各种效应分子。LPS/TLR4介导的MyD88依赖性途径中通过激活MyD88/IL-1R相关激酶/TRAF6激活MAPK（ERK、p38和JNK）和NF-κB通路,从而产生促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-a等；而LPS始动的MyD88非依赖途径通过活化TRIF依赖的IRF的激活调节IFN诱导基因的表达,如：IFN-β的表达。为研究Tim-4抑制LPS/TLR4介导的巨噬细胞活化机制,本研究检测Tim-4过表达或阻断后MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径中的各关键蛋白。3.1 Tim-4通过MyD88依赖途径抑制LPS介导的巨噬细胞活化并参与调控巨噬细胞产生NO和促炎因子3.1.1 Tim-4过表达抑制NF-K B活化进而调控巨噬细胞产生NO和促炎因子课题进一步利用Tim-4过表达巨噬细胞研究NF-K B在Tim-4介导的巨噬细胞调控中的作用。Western Blot检测显示,与转染对照质粒细胞相比,LPS（终浓度100 ng/mL）刺激30 min及60min时Tim-4过表达RAW264.7细胞p-NF-K B p65蛋白的表达均显着降低,提示Tim-4过表达抑制巨噬细胞NF-K B活化。NF-K B抑制性配体预处理Tim-4稳定表达的小鼠的巨噬细胞RAW264.7及对照细胞,Griess法及ELISA检测LPS刺激后巨噬细胞产生NO及细胞因子的水平。结果显示,LPS刺激24h时,NF-кB抑制性配体未处理组,Tim-4转染的RAW264.7细胞NO分泌减少（22.59±1.13μM vs27.6±0.36μM,p<0.05）,TNF-α和IL-6的分泌降低（TNF-α:2956±96.81pg/mL vs 3634±96.81pg/mL;IL-6: 753.0±57.14 pg/mL vs 1121±64.16 pg/mL,p<0.05）;而NF-кB抑制性配体处理后,Tim-4转染的RAW264.7细胞NO、TNF-α和IL-6的分泌均与对照无显著性差异。上述结果显示,Tim-4过表达抑制NF-кB活化,进而抑制LPS介导的小鼠巨噬细胞NO及促炎因子的产生。3.1.2 Tim-4阻断型抗体促进NF-кB活化进而参与LPS介导的巨噬细胞通路的活化并参与其对NO和促炎因子的调控NF-кB是MyD88依赖途径中的关键转录因子,为研究NF-кB通路在Tim-4介导的巨噬细胞调节中的作用,我们利用终浓度为5μg/mL的Tim-4阻断型抗体预处理小鼠腹腔巨噬细胞,Western Blot检测显示,LPS刺激30min及60min时,Tim-4阻断型抗体预处理组p-NF-κB p65蛋白的表达升高,提示Tim-4信号的阻断促进了NF-K B通路的活化。进一步利用NF-K B抑制性配体预处理腹腔巨噬细胞30min后加入小鼠Tim-4阻断型抗体（终浓度为5 u g/mL）处理1h,Griess法及ELISA检测LPS刺激后巨噬细胞产生NO及细胞因子的水平。结果显示,LPS刺激24h,NF-кB抑制性配体未处理组,Tim-4阻断型抗体作用巨噬细胞NO分泌增加（36.57±1.84μMvs27.27±1.53μM,p<0.05）,且TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌增加（TNF-α：4270±152.8 pg/mL vs 3461±237.2 pg/mL；IL-1β：1842±157.94 pg/mL vsl304±130.4 pg/mL；IL-6:1340±117.3pg/mL vs850.3±73.04 pg/mL,p<0.05）；而NF-кB抑制性配体处理组,Tim-4阻断型抗体处理后NO及TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌均无统计学差异。综上,Tim-4阻断型抗体促进LPS介导的巨噬细胞内NF-кB活化,抑制NF-кB后可以有效逆转Tim-4阻断性抗体对巨噬细胞产生NO及细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的促进作用。3.2 Tim-4抑制巨噬细胞MAPK通路活化MAPK活化是MyD88依赖性途径中另一重要环节。本研究设计利用抗体阻断及过表达,进一步研究MAPK通路在Tim-4介导的巨噬细胞调控中的作用。3.2.1 Tim-4过表达抑制巨噬细胞MAPK通路活化pcDNA3.0-Tim-4转染小鼠腹腔巨噬细胞（pcDNA3.0转染组为对照）后LPS刺激不同时间,Western Blot检测不同MAPK蛋白组成的表达。结果显示,与RAW264.7-pcDNA3.0组细胞相比,Tim-4转染的RAW264.7细胞在LPS刺激不同时间后细胞内p-p38和p-ERK1/2蛋白的表达显著降低,提示Tim-4过表达抑制MAPK通路活化。3.2.2 Tim-4阻断型抗体促进巨噬细胞MAPK通路活化利用终浓度为5μg/mL Tim-4阻断型抗体及对照IgG预处理小鼠腹腔巨噬细胞,Western Blot检测MAPK通路关键分子表达。结果显示,LPS刺激15min、30min及60min时,Tim-4阻断型抗体预处理组p-p38和p-ERK1/2蛋白的表达显著上调,提示阻断Tim-4促进MAPK通路活化。上述结果显示,Tim-4抑制小鼠巨噬细胞MAPK通路的活化。3.3.Tim-4抑制小鼠巨噬细胞IRF3的活化文献证实,MyD88非依赖性途径亦是LPS/TLR4激活巨噬细胞的重要机制。为进一步研究Tim-4调节LPS介导的巨噬细胞活化的分子机制具有重要意义。3.3.1 Tim-4过表达抑制小鼠巨噬细胞系中LPS介导的IRF3活化Western Blot检测p-IRF3蛋白表达。结果显示,与转染空载体的RAW264.7细胞相比,转染pcDNA3.0-Tim-4的RAW264.7细胞在LPS刺激15min、30min及60min后细胞内p-IRF3蛋白表达均显著降低,提示Tim-4过表达抑制IRF3信号通路的活化。3.3.2 Tim-4阻断型抗体促进腹腔巨噬细胞中LPS介导的IRF3的活化Western Blot结果显示,与对照组相比,Tim-4阻断型抗体预处理的小鼠腹腔巨噬细胞表达p-IRF3水平上调,提示阻断Tim-4信号促进了LPS/MyD88非依赖途径中IRF3的活化。上述结果提示,Tim-4抑制小鼠巨噬细胞IRF3活化,通过MyD88非依赖性途径调节巨噬细胞功能。综上,Tim-4通过抑制小鼠巨噬细胞NF-κB、ERK1/2、p38和IRF3的活化抑制LPS介导的巨噬细胞活化。二、Tim-4对poly（I：C）介导的小鼠巨噬细胞分泌NO的负调节作用及机制为了进一步研究Tim-4对巨噬细胞功能的调控,我们初步探讨了Tim-4对poly（I:C）介导小鼠巨噬细胞分泌NO的调控作用及机制。1. poly（I:C）促进小鼠腹腔巨噬细胞Tim-4 mRNA的表达不同浓度poly（I:C）刺激小鼠腹腔巨噬细胞24h,RT-PCR检测Tim-4表达。结果显示,20μg/mL和50μg/mL poly（I:C）刺激后小鼠腹腔巨噬细胞Tim-4 mRNA表达升高（p<0.05）。2.Tim-4抑制poly（I：C）介导的小鼠巨噬细胞NO的分泌2.1 Tim-4过表达抑制poly（I:C）活化小鼠巨噬细胞系RAW264.7 NO的分泌Griess法检测显示,poly（I:C）刺激24h后,与对照细胞相比,Tim-4稳定表达巨噬细胞的NO分泌明显降低（25.13±1.6μMvs16.45±1.9μM,p<0.05）2.2 Tim-4阻断型抗体促进poly（I:C）活化小鼠腹腔巨噬细胞NO的分泌Griess法检测结果显示,与对照IgG相比,终浓度为5μg/mL的抗体阻断Tim-4可以促进poly（I:C）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NO的产生（20.47±1.85μM vs26.73+1.19μM,p<0.05）。3 NF-KB信号通路参与Tim-4抑制poly（I:C）介导的小鼠巨噬细胞NO的分泌poly（I:C）与巨噬细胞表面TLR3结合引起NF-кB通路的活化进而启动一系列基因的转录,如iNOS的表达。3.1阻断NF-кB逆转Tim-4过表达对poly（I:C）介导小鼠巨噬细胞系RAW264.7分泌NO的抑制作用我们进而利用Tim-4过表达巨噬细胞验证NF-K B在Tim-4调控巨噬细胞分泌NO中的作用。NF-K B抑制性配体预处理Tim-4稳定表达的小鼠巨噬细胞系RAW264.7及对照细胞30min后,poly（I:C）刺激24h,收集培养上清。Griess法检测显示,NF-K B抑制性配体未处理组,RAW264.7-pcDNA3.0-Tim-4细胞与对照细胞相比,NO分泌下调（14.93±1.24μM vs 21.27±1.7μM,p<0.05）;而NF-кB抑制性配体处理组,RAW264.7-pcDNA3.0-Tim-4细胞与对照细胞相比,NO分泌无差异（p<0.05）。3.2阻断NF-кB逆转Tim-4阻断型抗体对poly（I:C）介导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO的促进作用为了研究阻断Tim-4是否通过NF-кB调控NO的分泌,我们利用NF-кB抑制性配体及对照预处理腹腔巨噬细胞30min,然后加入羊IgG及羊抗小鼠Tim-4阻断型抗体（终浓度为5μg/mL）处理1h,Griess法检测显示,poly（I：C）刺激24 h,NF-кB抑制性配体未处理组,Tim-4阻断型抗体组NO分泌较羊IgG明显增加（33.23±1.31μM vs 22.6±1.35μM,p<0.05）；而NF-кB抑制性配体处理后,Tim-4阻断型抗体组NO分泌与羊IgG对照组无显著性差异。综合以上结果,提示Tim-4可通过NF-кB通路抑制poly（I:C）活化的小鼠巨噬细胞NO的分泌。三、Tim-4对IFN-γ介导的小鼠巨噬细胞分泌NO的负调节作用IFN-γ是巨噬细胞活化的另一重要刺激剂。为全面了解Tim-4对活化巨噬细胞的调控,我们以IFN-γ活化的巨噬细胞为研究对象,进一步探讨Tim-4对活化巨噬细胞的调控。1.IFN-γ上调小鼠腹腔巨噬细胞Tim-4 mRNA的表达RT-PCR结果显示,100U/mL IFN-γ刺激小鼠腹腔巨噬细胞6h、12h和24h后,Tim-4 mRNA的表达于24h显著上调（p<0.001）。2.Tim-4抑制IFN-γ介导的小鼠巨噬细胞NO的分泌及iNOS的表达2.1 Tim-4过表达抑制小鼠巨噬细胞系RAW264.7 NO的分泌及iNOS的表达利用本课题组前期成功筛选获的得稳定表达小鼠Tim-4的巨噬细胞系RAW264.7-pcDNA3-Tim-4, Griess法检测显示,经IFN-γ刺激24h,稳定表达Tim-4细胞系NO的分泌低于对照细胞系RAW264.7-pcDNA3（19.33±μM vs24.93±1.507μM,p<0.05）。Western Blot检测显示,经IFN-γ刺激12h,稳定表达Tim-4细胞系iNOS蛋白表达亦低于对照细胞系。2.2 Tim-4阻断型抗体促进IFN-γ活化小鼠腹腔巨噬细胞NO的分泌及iNOS的表达我们利用Tim-4阻断型抗体预处理小鼠巨噬细胞,进一步研究封闭Tim-4对巨噬细胞功能的影响。Griess法检测结果显示,与对照IgG相比,利用终浓度为5μg/mL抗体阻断Tim-4可以促进IFN-γ活化的小鼠腹腔巨噬细胞NO的产生（21.6±1.78μM vs 28.13±0.96μM,p<0.05）。Western Blot检测显示5μg/mL Tim-4抗体阻断组,iNOS蛋白的表达亦上调。3.Tim-4抑制小鼠巨噬细胞Jak2/Statl信号通路的活化IFN-Y与细胞表面受体结合可招募Jak2并发生磷酸化,而磷酸化的Jak2（p-Jak2）可使Statl磷酸化,磷酸化的Statl （p-Statl）入细胞核内结合到iNOS启动子区,启动iNOS的表达,而iNOS是NO合成的限速酶。Western Blot检测显示,终浓度为5μg/mL Tim-4阻断型抗体预处理腹腔巨噬细胞,IFN-γ刺激30 min及60min时,与对照组相比,Tim-4阻断型抗体预处理的细胞p-Jak2及p-Statl蛋白的表达上调,可见Tim-4信号的阻断上调了Jak2/Statl通路的活化。以上结果提示,Tim-4可能通过抑制IFN-γ/Jak2/Statl信号通路的活化从而抑制NO的产生。综上所述,活化巨噬细胞Tim-4表达上调,上调的Tim-4通过抑制一系列信号通路分子抑制巨噬细胞NO的分泌及细胞因子的分泌,这些结果为阐明Tim-4对巨噬细胞功能的调控作用奠定了良好的基础,为巨噬细胞参与的炎症反应提供了良好的靶点。