褪黑素对人肺腺癌A549细胞的影响

论文摘要

背景：肺癌在全世界各个国家发病率都很高，且转移率死亡率也很高，其早期诊断率低，发现时多属中晚期，虽然治疗方法多样，各种治疗方法疗效均不佳，5年生存率低。近年来在体内外的研究中发现褪黑素有明确的抗肿瘤作用。但是关于褪黑素与肺癌关系的研究不多。核转录因子κB是一种重要的细胞因子，活化后能从胞浆移位进入核内，与目的DNA结合，调节下游相关基因的转录。在肿瘤细胞中核转录因子κB通常处于异常活化状态，与肿瘤的增殖、迁移、侵袭等生物学过程密切相关，抑制其活性已成为肿瘤治疗的方向之一。临床观察中发现，褪黑素能增强化疗疗效、提高晚期肺癌患者生存率，但未见相关的机制研究。有关细胞的研究发现，褪黑素对核转录因子κB的活性有抑制作用，肺癌的研究中未见报道。我们推测褪黑素可能通过抑制肿瘤细胞核转录因子κB活性来发挥抗肿瘤作用，因此我们设计在体外培养人肺腺癌A549细胞，以不同浓度的褪黑素干预，观察细胞的增殖、迁移、侵袭的情况，明确褪黑素对非小细胞肺癌的作用，并测定转录因子κB的核移位情况，从而推断转录因子κB在褪黑素抗肿瘤过程中的作用。第一部分：褪黑素对体外肺腺癌A549细胞增殖的影响目的：探讨褪黑素对体外肺腺癌A549细胞增殖的影响，并初步探讨其可能的作用路径。方法：体外培养人肺腺癌A549细胞，将细胞分为5组，分别用含5mmol/L、2.5mmol/L、1mmol/L、0.1mmol/L、0mmol/L的褪黑素的培养液培养。1、用噻唑蓝（MTT）法测24h、48h、72h的增殖情况；2、DNA末端原位标记染色法（TUNEL）检测各浓度褪黑素干预48h后细胞凋亡情况；3、免疫组织化学方法初步判断各组细胞干预48h后核转录因子κB的核移位情况；4、Western-blot方法测定各组细胞干预48h后抗凋亡相关蛋白Bcl2和凋亡相关蛋白Caspase3表达情况。结果：1、高浓度的褪黑素能够直接抑制人肺腺癌A549细胞的增殖，低浓度的褪黑素对增殖无明细影响，随着时间的延长，抑制作用增强。2、高浓度褪黑素干预后细胞凋亡率明显提高，低浓度无明显影响。3、免疫组化结果显示，高浓度褪黑素干预后细胞核内核转录因子κBp65阳性率降低。4、褪黑素能够调节Bcl2、Caspase3蛋白的表达，随着褪黑素浓度的升高，Bcl2蛋白表达水平降低、Caspase3表达水平升高。结论：褪黑素能够呈剂量-时间依赖性的抑制人A549细胞的体外增殖，作用机制可能是褪黑素通过抑制NF-κB的核移位调节Bcl2、Caspase3等蛋白的表达增加细胞的凋亡率。第二部分：褪黑素与多柔比星对肺腺癌A549细胞的协同作用及褪黑素对细胞迁移、侵袭能力的影响目的：探讨褪黑素与常用化疗药物多柔比星联合用药对肺腺癌A549细胞的作用，并观察褪黑素对肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力的影响。方法：1、将体外培养的人肺腺癌A549细胞分为9组，分别用0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L褪黑素与0ug/ml、0.2ug/ml、2ug/ml多柔比星组合干预48h，噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖情况；2、细胞划痕法检测0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L褪黑素对肺腺癌A549细胞迁移能力的影响；3、Transwell侵袭小室测定法分析0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L褪黑素对肺腺癌A549细胞侵袭能力的影响；4、Western-blot法检测0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L褪黑素对A549细胞核转录因子Bp65核移位的影响。结果：1、0.1mmol/L、1mmol/L褪黑素单独使用48h对肺腺癌A549细胞无明显抑制增殖的作用，与多柔比星合用时可明显提高多柔比星对细胞的抑制作用。2、划痕实验结果显示褪黑素对细胞的迁移能力有抑制作用，且呈剂量依赖性。3、Transwell侵袭小室测定实验显示褪黑素对细胞的侵袭能力有抑制作用，随着浓度增加抑制作用增强。4、Western-blot结果提示褪黑素能使核转录因子Bp65核位移减少，并呈剂量依赖性。结论：褪黑素与多柔比星之间存在协同作用。褪黑素对肺腺癌A549细胞的迁移、侵袭能力有抑制作用，其作用机制可能是抑制转录因子B的核移位。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 一、肺癌的流行、治疗现状
• 二、褪黑素与肿瘤
• 三、核转录因子 κB 与肿瘤
• 第一部分 褪黑素对体外肺腺癌 A549 细胞增殖的影响
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 实验主要仪器
• 1.3 实验主要试剂
• 1.4 主要溶液配制
• 2 方法
• 2.1 人肺腺癌 A549 细胞复苏培养
• 2.2 实验分组
• 2.3 MLT 配制
• 2.4 MTT 检测
• 2.5 制作细胞爬片
• 2.6 TUNEL 染色检测早期凋亡细胞比例
• 2.7 免疫组化染色观察 NF-κBp65 核移位情况
• 2.8 Western-blot 方法检测抗凋亡相关蛋白 Bcl2 和凋亡相关蛋白Caspase3 表达
• 2.9 统计分析
• 3 结果
• 3.1 MTT 结果
• 3.2 TUNEL 染色早期凋亡细胞计数结果
• 3.3 免疫组化染色结果
• 3.4 Western-blot 检测结果
• 4 讨论
• 第二部分 褪黑素与多柔比星对肺腺癌 A549 细胞的协同作用及褪黑素对细胞迁移、侵袭能力的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 实验分组
• 2.3 药物配制
• 2.4 MTT 检测
• 2.5 划痕实验
• 2.6 Transwell 侵袭小室测定实验
• 2.7 Western-blot 方法检测细胞核内 NF- Bp65 蛋白量
• 2.8 统计分析
• 3 结果
• 3.1 MTT 结果
• 3.2 划痕实验结果
• 3.3 Transwell 侵袭小室测定实验结果
• 3.4 Western-blot 检测结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢