论文摘要
第一部分：机械牵张对对细胞活性和炎性因子IL-8表达的影响目的本研究以肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞为研究对象,应用细胞力学方法研究A549细胞在周期性机械牵张作用下细胞凋亡和细胞因子分泌的情况,为VILI发生机制提供新的理论依据。方法选取周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞,用细胞拉伸加载装置模拟机械通气,根据实验设计要求,给予加载应力为15%,加载频率0.5Hz,加载时间分别为0min、15min、30min、60min、120min,观察不同时间点的细胞凋亡情况。另外,给予加载应力为15%,加载频率0.5Hz,加载时间分别为0min、15min、30min、60min、120min,用ELISA和定量PCR研究不同牵张时间下炎性介质IL-8的蛋白和mRNA的表达情况。结果给予加载应力为15%,加载频率0.5Hz时,肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡随着时间的延长增加,IL-8的蛋白和mRNA的表达随着牵张时间的延长,表达增高。结论机械牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞A549能引起细胞凋亡和导致下游炎性因子IL-8的分泌,本项实验从细胞力学水平上为机械通气性肺损伤提供了理论依据。第二部分：Cyr61基因SiRNA表达载体的构建目的Cyr61是张力敏感基因,我们希望应用SiRNA介导的RNA干扰技术抑制机械牵张导致的Cyr61表达上调,观察肺损伤的程度,进一步了解机械牵张致肺损伤的机制。方法根据GenBank数据库提供的Cyr61基因核苷酸序列,选择设计3条能转录SiRNA的DNA序列,命名Cyr61-1 SiRNA、Cyr61-2 SiRNA、Cyr61-3 SiRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil1.1载体,转化扩增后进行序列测定。4种重组表达载体转染肺癌A549细胞,逆转录RT-PCR和Western印迹法分别从mRNA和蛋白水平检测Cyr61的表达。结果经酶切鉴定和测序证实Cyr61靶向SiRNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为60.54%和52.97%。结论Cyr61靶向SiRNA重组表达载体构建成功并能显著抑制Cyr61基因的表达,这为进一步探索Cyr61基因功能提供了理论依据。第三部分：干扰Cyr61表达对A549细胞活性的影响目的本实验拟研究周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞对Cyr61表达的影响,及干扰Cyr61基因表达对机械牵张引起A549细胞活性改变的影响方法①对肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞施加周期性机械牵张应力,加载频率0.5Hz,加载时间2h,加载应力分别为5%、15%、30%。加载应力为15%,加载频率0.5Hz,加载时间分别15min,30min,60min,120min。每个实验组均设立空白对照即不给予机械应力。用PCR法测定Cyr61mRNA的表达,用western法测定Cyr61蛋白含量。②设立阴性转染牵张组（牵张前48h转染特异性空白质粒）、阳性转染牵张组（牵张前48h转染特异性cyr61 SiRNA）、空白对照组。然后给予加载应力,加载幅度15%,加载频率0.5Hz,加载时间为2h,用流式细胞仪检测A549细胞的凋亡情况。结果随着加载应力的增加和加载时间的延长,Cyr61蛋白含量和mRNA表达均增加；另外施加不同加载幅度后,Cyr61蛋白含量和mRNA表达均增加。结论肺泡Ⅱ型上皮细胞Cyr61的产生和释放与周期性的机械牵张应力呈强度和时间依赖性。牵张引起Cyr61基因和蛋白表达,导致肺泡上皮细胞凋亡增加,这可能参与了VILI的发病机制。第四部分：Cyr61在机械牵张作用下肺泡Ⅱ型上皮细胞转导机制中的研究目的本研究以肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞为研究对象,观察Cyr61在牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞过程中对NF-kB活性及其下游炎性因子表达的影响。方法①周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,牵张时间为0min、15min、30min、60min、120min。用western blot检测核转录因子（NF-KB）RelA、IkB-α的表达情况。②另设立阴性转染牵张组（牵张前48h转染特异性空白质粒）、阳性转染牵张组（牵张前48h转染特异性Cyr61SiRNA）、空白对照组,然后给予加载应力,加载幅度15%,加载频率0.5Hz,加载时间为15min、30min、60min、120min。用western blot检测核转录因子（NF-KB）RelA、IkB-a的表达情况。③干预方式同上,用ELISA和定量PCR研究不同牵张时间下炎性介质IL-8的蛋白和mRNA表达情况。结果western blot结果显示RelA 15min开始增高,30min达到高峰,后又降至正常水平。IkB-α的表达于15min开始降低,30min达到高峰,后又降至正常水平。与阴性转染牵张组比,阳性转染牵张组明显抑制Re1A的易位和IkB-α的降解。IL-8蛋白和mRNA的表达水平显著降低。结论牵张引起Cyr61激活,导致下游NF-kB通路的激活,从而上调致炎因子IL-8的表达导致肺损伤。
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