对流行区日本血吸虫病诊断方法的评估以及建立估算流行率的血清学模型

论文摘要

日本血吸虫病仍是威胁我国人民身体健康的重要感染性疾病之一。根据2006年全国血吸虫病疫情通报,目前共有血吸虫病人671265人,其中晚期血吸虫病28939人,慢性血吸虫病642119人,急性血吸虫病207人。血吸虫病的防治面临严峻挑战。在血吸虫病的防治中,流行率和感染程度的监测是主要考核指标,也是流行病学家评估疾病严重程度、考核防治效果、制定和调整防治策略、预测疾病发展趋势的依据,同时也是影响政府部门对疾病重视程度和资金投入决策的关键。然而,由于缺乏足够敏感和特异的血吸虫病诊断方法,获得准确的血吸虫病流行资料仍是目前血防工作的难题之一。迄今为止,粪检仍是血吸虫病唯一的“确定性诊断”方法,但因该方法的群众依从性差,缺乏足够的敏感性,其实用性和可靠性受到很大挑战。尤其是自20世纪80年代初,抗血吸虫药物吡喹酮的大规模使用,导致血吸虫病流行区人群的感染度和流行率大幅下降,其敏感性进一步受到质疑。免疫学（以血清学方法为主）诊断方法因其简便易行、依从性好、灵敏度高等特点,在血吸虫病防治中的应用日益受到重视。目前,抗体检测在现场工作中被广泛采用。血吸虫病特异性抗体诊断通常以非疫区人群抗体水平为参考确定阳性判断值,如市售的ELISA检测抗体盒,以非疫区人群抗体水平“均值的2.1倍”或者“均值+2倍/3倍标准差”作为阳性判断值。但是由于抗体在机体内受免疫系统总体调节的影响,化疗后很长时间内仍在体内保持一定的水平,且其在体内的水平和转归具有个体差异性,导致“感染人群”与“感染治愈人群”及“非感染人群”的抗体水平分布具有一定程度的重叠,因此,在现场使用时,抗体检测存在难以区分现症与过去感染的困难。为了探索合适的血吸虫病诊断方法,尤其希望对流行区血吸虫病流行率做出较为准确的估计,本研究对目前常用的血吸虫病血清学诊断方法进行分析评估,并评价了粪检模型用于流行率估计的可靠性,在此基础上构建了流行区人群特异性抗体水平分布的血清学模型,并将其用于血吸虫病流行区的流行率估计。在本研究中,采用间接ELISA法检测抗体,得到定量的特异性抗体水平。而所有分析和模型构建数据均来自于标准化后的结果。主要研究内容如下:研究内容一:建立对间接ELISA结果进行标准化的方法通过间接ELISA法来定量检测大量样本的抗体水平时,存在板间结果难以比较的问题。由于我们研究的样本量大,一个现场人群的抗体检测至少历时一个月。因此,确定有效的对ELISA结果进行标准化的方法成为首要任务。由于ELISA实验的结果受时间、温度、酶活性、各步反应时间等诸多因素影响,使得不同实验人员、在不同时间所做实验的结果之间缺乏可比性。虽然已知数种ELISA结果的标准化方法,但尚无一种方法既简便实用又能有效地对大量样本的抗体水平进行标准化。我们根据间接ELISA的反应动力学过程,推导建立了一种新的间接ELISA结果标准化方法I-STOD（Improved STandardization method forOptical Density）。该方法可将ELISA结果的OD（Optical Density）值转化成相对于标准品的相对抗体浓度。通过在每块ELISA板上统一使用合适的血清作为标准品,建立I-STOD标准曲线,可将各板上的结果进行标准化和统一化,从而使结果间具有可比性。我们通过一组实验,利用23块ELISA板的实验结果,评价了该标准化方法的有效性,并与5种目前常用的标准化方法作了比较。结果显示,以I-STOD方法拟合的标准曲线与实验结果吻合很好,是拟合优度最好的模型之一;采用I-STOD方法对OD值进行标准化后,同一样本在不同板上检测结果的变异系数（CV,coefficient ofvariation）显著减小;通过质控品,采用控制图对实验结果进行质量控制,标准化前大量ELISA板的结果显示不在控制图的正常范围内,而采用I-STOD方法对OD值进行标准化后,ELISA板上结果的失控率降至最低,显著提高了实验结果的可利用率。因此,I-STOD法是一种简单、有效的对抗体水平进行标准化的方法,可缩小检测值的板间差异,提高不同板上结果的可比较性。研究内容二:对ELISA法检测特异性抗体水平用于血吸虫病诊断的功效评估本研究的现场为江西省上饶市余干县瑞洪镇驾湖村和浙江省江山市何家山乡麻车村,前者（此后称江西现场）为日本血吸虫病流行现场,分别于2005年和2006年连续两年对该现场人群进行调查,后者（此后称浙江现场）于1995年达到血吸虫病传播阻断标准,近10年无新感染病人报告,于2005年对该现场人群进行调查。采集人群（年龄5-65岁）的粪便和血清标本。在一周内分两天对研究对象各采集粪样1份,每份粪样制作3张kato片（称“2检6片”）。读片获得定量的粪检结果（每克虫卵数,EPG）;采用间接ELISA法检测血清中可溶性虫卵抗原（Soluble egg antigen,SEA）特异的IgG和IgM水平,并使用I-STOD方法将所有的结果（OD值）转化成标准化的抗体浓度,为后续分析提供可靠的数据。以江西现场2005年和/或2006年粪检结果为阳性的人构成血吸虫病病例组,以浙江现场人群作为阴性对照组,采用I-STOD方法标准化后的抗体水平,分析SEA特异的IgG与IgM在采用不同的诊断界值时的诊断功效,并将其与试剂盒的诊断标准进行比较。结果显示,IgM的诊断价值高于IgG,试剂盒的阳性判断标准并非最佳诊断标准。IgG与IgM联合诊断（并联诊断）并没有提高诊断功效。此外,我们还建立了多个不同变量（包括IgG、IgM、ln（IgG）、ln（IgM）、年龄、性别）与粪检结果的Logistic回归模型,并以Logistic回归模型预测的感染概率作为诊断指标,分析其诊断功效。结果显示,以ln（IgM）和年龄作为自变量的Logistic预测模型的诊断功效较IgM单独诊断略有提高,但二者没有显著差异。以上分析说明,SEA特异性IgG和IgM的诊断功效很难得到显著提高。究其原因,抗体水平的分布特征是症结所在,血吸虫感染（粪检）阳性人群和阴性人群的特异性抗体水平分布存在明显交叠。研究内容三:建立估算日本血吸虫病流行率的血清学模型对于血吸虫病的诊断,粪检方法的特异度高,但存在灵敏度低的缺陷,难以用于确切的流行率评估。虽然有不少基于血吸虫病粪检结果来估算流行率的数学模型见诸报道,但迄今为止,尚无一被实际应用于现场流行率的估算。其中,余金明等建立了基于日本血吸虫虫卵负二项分布的随机效应模型,并据此绘制了适于现场应用的袖珍图,旨在根据一次粪检观察到的人群血吸虫感染度和阳性率,从该袖珍图上估计人群“实际感染率”。我们利用所采集的现场资料,分析评估了该袖珍图的应用效果。结果发现,根据“1检2片”粪检结果,从该袖珍图得到人群的“实际感染率”几乎相当于“2检6片”粪检的阳性率,很可能低于“真实的感染率”,该袖珍图的现场应用价值值得商榷。我们在研究内容二中的分析表明,血吸虫病流行现场调查全人群的IgM和IgG抗体分布均为混合分布,即包括现症感染、既往感染和无感染等人群的抗体水平分布。通过混合分布拆分的方法,将不同感染状态的人群分开,有望更直观、更科学地估计血吸虫病流行率。我们观察到,研究试区人群（包括血吸虫病流行区调查全人群——2005年江西现场和2006年江西现场、传播阻断地区调查全人群——浙江现场、以及江西现场两年粪检阳性人群）中SEA特异性IgG与IgM的抗体水平分布均呈极度的正偏态分布,为了正确使用正态分布的理论和方法进行分析,我们对IgG与IgM的原始浓度值进行适当变换（Box-cox变换）,使各个人群的抗体水平分布接近正态分布。变换后,粪检阳性人群的抗体水平分布近似正态分布（P＞0.1）,浙江人群的抗体水平分布很集中,虽然略有偏度,但不明显。值得注意的是,江西现场两年调查全人群的抗体水平分布并非正态分布,显示在分布主峰的右侧人数偏多,这一结果提示,该分布可能是包含了不同血吸虫感染状态人群抗体水平分布的混合分布。进一步对粪检阳性人群抗体水平分布的分析发现,特异性IgM和IgG抗体水平均与感染度具较弱的相关性（相关系数r分别为0.3300（P＜0.001）和0.2966（P＜0.001））;随着EPG值的降低,人群的抗体水平分布（IgM和IgG）有向低值移动的趋势;同样,随着阳性粪样数（每检粪样所作3张Kato片中只要有1片检出血吸虫虫卵即记做阳性粪样）和阳性检出片数（合计2检粪样的6张Kato片中读片结果为阳性的片数）的减少,人群的抗体水平分布（IgM和IgG）亦有向低值移动的趋势;上述结果提示,在“2检6片”粪检漏检的人群中,至少有一部分人的IgM和IgG抗体水平比“2检6片”检出的阳性人群的低,但高于真正阴性的人群。因此,我们推测,在“2检6片”阳性人群抗体水平分布位置的低处,还存在一个粪检漏检的阳性人群抗体水平分布。根据以上分析,我们假设研究现场调查全人群IgM与IgG抗体水平的混合分布模型都由4个正态分布构成,其中,抗体水平最低的一个分布（即左侧第1个分布）是无感染者或治愈10年以上的历史感染者的分布,抗体水平次低的一个分布（即左侧第2个分布）代表的是历史感染血吸虫、经治疗已无活动性感染但抗体水平还处于衰减过程中人群的分布,抗体水平最高的两个分布（即左侧第3个分布和第4个分布）都是现症感染者的分布,其中第3个分布是粪检不易检出的感染人群的分布,第4个分布是粪检较易检出的感染人群的分布。因此,利用EM算法,我们分别将全人群IgM与IgG抗体水平的混合分布模型拆分成4个子分布,并计算血吸虫病的流行率。根据IgM混合分布模型,2005年和2006年江西调查人群的血吸虫病流行率分别为42.96%和44.73%;根据IgG混合分布模型,分别为37.56%和42.45%。此外,我们还对该模型预测的流行率进行了初步验证。结果表明,IgG模型并未正确区分各个不同感染状态人群,而IgM模型可能作为一个有效的模型用于血吸虫病疫区流行率的估计,值得进一步研究。综上所述,我们对两个不同类型的血吸虫病现场的粪检及血检资料的分析表明,无论是直接的粪检结果还是采用随机效应模型的袖珍图,以Kato-Katz技术并不能准确得到血吸虫病流行现场的流行率;而ELISA抗体诊断方法用于确定感染者虽有一定的诊断价值,但血吸虫虫卵抗原特异性IgM水平的混合分布模型可能更准确地从群体水平对血吸虫病疫区的流行率进行估计。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 建立间接ELISA结果标准化方法—I-STOD
• 引言
• 材料和方法
• 结果与分析
• 一、I-STOD方法的建立
• 二、I-STOD方法的评价与应用
• 讨论
• 第二部分 对日本血吸虫病血清学诊断方法的评估
• 引言
• 材料和方法
• 结果与分析
• 讨论
• 第三部分 建立估算日本血吸虫病流行率的血清学模型
• 引言
• 材料和方法
• 结果与分析
• 一、粪检结果及对随机效应模型袖珍图的评估
• 二、建立估算日本血吸虫病流行率的血清学模型
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1 STATA中I-STOD的计算程序
• 附录2 EM算法用于混合正态分布的程序
• 附录3 在读期间发表的文章
• 综述