论文摘要
目的:构建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体,研究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）空泡毒素单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞分泌和凋亡的影响,以及核因子kappa B （nuclear factor kappa B,NF-κB）在调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞功能中的作用。方法:用PRIMER5.0软件设计引物,PCR扩增vacA全基因;将PCR产物纯化后插入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,Western-blot鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄取试验检测巨噬细胞的空泡样变;ELISA法检测巨噬细胞培养上清IL- 1β、TNF-α含量;Griess试剂分析培养上清的NO水平;荧光探针DCFH-DA检测培养上清的ROS;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;凝胶阻滞试验（electrophoretic mobility gel shift assay ,EMSA）检测NF-κB的核转位。结果:（1）双酶切及测序结果显示,成功构建真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/vacA;（2）转染后24h用倒置荧光显微镜观察发现,空质粒组表达的单纯红色荧光蛋白,其荧光在细胞内呈弥散性分布,而重组质粒组表达的VacA与红色荧光蛋白的融合蛋白,在细胞质形成聚集的荧光颗粒;Western-blot结果发现重组质粒转染组出现一条免疫反应带,而空质粒转染组和THP-1巨噬细胞组未见免疫反应带;（3）重组质粒转染THP-1巨噬细胞24h,部分细胞胞浆中出现大小不等的空泡;中性红摄取实验显示转染后6h,重组质粒组中性红摄取量明显升高,与对照组相比差异有显著性（P <0.05）;而转染后24h,重组质粒组的吸光度达到最高;（4）转染后6h,重组质粒组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显高于阴性对照组（P<0.05）;且分别于转染后6h或24h到达峰值;（5）转染后6h或12h,重组质粒组培养上清中NO、ROS含量明显高于阴性对照组（P<0.05）;且于转染后24h达到高峰;（6）转染后16h,重组质粒组的凋亡率明显升高,与阴性对照组相比,差异有显著性（P﹤0.05）;（7）重组质粒组加NF-κB的特异性抑制剂PDTC后,IL-1β、TNF-α、NO、ROS的分泌量和细胞的凋亡率明显降低,与重组质粒组相比差异有显著性（P <0.05）;（8） EMSA实验显示,转染后3h细胞核内有活化的NF-κB,且于转染后12h活性最强。结论:（1）成功构建了pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体;（2） VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO和ROS;（3） VacA蛋白瞬时高表达诱导THP-1巨噬细胞凋亡;（4） NF-κB可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌和凋亡。