本文主要研究内容
作者张雪（2019）在《利用小分子抑制剂建立体内胚胎来源猪多能干细胞的研究》一文中研究指出：胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)是一种依赖于一定的体外条件,能够稳定的自我更新,并保持多能性的细胞类型,一般来源于植入前囊胚的内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)。众所周知胚胎干细胞具有能够无限期增殖的能力,并且可以分化为成体所有类型的细胞,这使得它们对药物开发和再生医学的研究具有特别重要的价值。不同状态的胚胎干细胞具有不同的多能性特征:Na?ve多能性状态,具有全面的分化潜能和嵌合体贡献能力,以小鼠胚胎干细胞为代表;Primed多能性状态,具有受限的分化能力和嵌合体贡献能力,以人类或灵长类胚胎干细胞为代表。而在其他大动物例如猪等物种中,Na?ve多能性状态的胚胎干细胞仍然未能成功获得。第一株小鼠胚胎干细胞系在含有胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和饲养层细胞的条件下建立,还有一种方式是通过添加白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)来促进小鼠胚胎干细胞系的建立。然而,在以上条件下,只有129/SV品系的小鼠胚胎能够有效的建立起胚胎干细胞系,而其他大多数品系的小鼠胚胎干细胞系的建立仍然存在困难。直到2008年,人们利用含有MEK和GSK3抑制剂的2i培养体系,从许多其他通常被认为无法成功获得干细胞系的小鼠品系中建立了胚胎干细胞系。同时,利用该体系也可成功从大鼠胚胎培养获得大鼠胚胎干细胞系。此外,通过筛选能够维持OCT4远端增强子活性的因子,建立了含LIF、Activin A和5种不同激酶抑制剂的5i/L/A培养体系,该体系可支持人Na?ve胚胎干细胞的自我更新,并能够将Primed状态的人胚胎干细胞转化为Na?ve多能性状态。然而,这些体系似乎对小鼠或人以外的其他物种的Na?ve多能性胚胎干细胞的建立没有效果。2017年,通过化学筛选,建立了一种添加了human LIF、CHR99021、(S)-(+)-dimethindene maleate(DiM)和minocycline hydrochloride(MiH)的培养基,称为LCDM,该条件下可同时从人和小鼠胚胎获得具有参与胚胎和胚外组织嵌合体发育能力的多能性干细胞系,这些细胞被称为扩展多能干(Extended Pluripotent Stem,EPS)细胞,此研究开辟了从不同哺乳动物建立具有嵌合体能力的多能干细胞的途径。猪不仅是主要的肉食来源动物,而且在代谢、免疫和生理上与人类非常相似,是生物医学研究理想的动物模型,此外由于其器官与人类器官大小相近,猪也是异种器官移植的潜在供体。因此,猪多能干细胞(porcine Pluripotent Stem Cells,pPSCs)的建立与培养已成为科学家们的研究热点。然而,目前已发表的猪多能干细胞系都被证明是类胚胎干细胞系,这些细胞系大多表现出有限的多能性特征,无法形成畸胎瘤或生殖系嵌合体。因此,真正的猪多能干细胞系的建立与获得是十分值得期待的。为了从猪胚胎中建立多能干细胞人们已经做了许多努力。虽然尚未获得真正的猪胚胎干细胞系,但已从各种不同来源的猪胚胎中建立获得了许多假定的猪多能性干细胞系。然而,与小鼠胚胎干细胞相比,这其中大多数细胞系的多能性都差强人意,具体表现为这些猪多能干细胞注入裸鼠皮下无法畸胎瘤或者嵌合后不能参与到生殖系的发育中。先前的研究表明,不同来源的猪胚胎干细胞系表现出克隆形态扁平的特征,并且其体外和体内的分化能力有限。它们在细胞多能性分类上属于Primed状态,而非Na?ve状态。据此,本研究采用猪体内6.5天囊胚,利用LCDM体系,尝试建立猪多能性干细胞,并通过小样本高通量测序分析LCDM体系获得的猪多能性细胞及小鼠、人EPS细胞中多能性基因表达模式和相关信号通路活性状态。我们获得的结果表明:(1)在不同体系下利用猪体内胚胎建立的多能性干细胞系均取得较好的效果。其中KOFL培养体系下,在接种2枚猪体内胚胎的情况下成功获得了1株猪多能干细胞系PeNK6,获得的细胞克隆形态与人胚胎干细胞相似,呈现出一种扁平的单层细胞的状态,碱性磷酸酶(AP)检测的结果表明该细胞系呈阳性的结果,即该细胞系具有多能性细胞的基本特征,免疫荧光检测表达核心转录因子OCT4,SOX2,NANOG,定量PCR检测核心转录因子的表达结果与免疫荧光结果相一致。(2)在LCDM培养体系下,采用MEF或STO作为饲养层,对猪多能性干细胞建系效率不存在明显的差别。获得猪多能干细胞系,克隆形态呈扁平状,但更加紧密,呈AP阳性,表达核心转录因子OCT4,SOX2,NANOG,同时细胞还表达SSEA3和SSEA4。具有体外分化的能力。(3)获得的细胞系进行了小样本高通量测序分析,对小鼠,人和猪三个物种获得的EPS/PSC中Na?ve和Primed相关基因的表达进行了比较分析,发现小鼠,人和猪中LCDM体系下建立的EPS细胞或PSCs并不同于ESCs细胞或ICM细胞的多能性特征,虽然都会有核心转录因子的表达,但部分Na?ve和Primed相关基因的表达还是会存在差异。此外,对多能性信号通路激活情况也进行了比较分析,结果显示在LCDM培养体系中猪多能性干细胞中TGFβ信号通路处于高活性状态,这可能是影响该体系下获得猪多能性干细胞系多能性的原因之一。据此,我们在LCDM培养基中添加TGFβ信号通路抑制剂SB431542。结果显示,与pPSC-LCDM细胞系相比优化体系培养的细胞不仅核心转录因子的表达有所提高,细胞的增殖能力也显著性增强。进一步,通过小样本高通量测序,我们建立了ICM向pPSC-LCDMs转变过程中的基因表达图谱。结果显示ICMs,BOs(blastocyst outgrowths)和PSCs的转录组具有较大差异,在胚胎接种后第1天,转录组即发生较大变化。结果显示ICMs,BOs和PSCs的转录组具有较大差异,且BO5是获得多能性干细胞过程中多能性变化的关键转折点。通过以上的结果,我们获得以下结论:(1)在LCDM体系下,利用猪体内胚胎建立猪多能性干细胞系的效率较高,建系效率可达50%左右,而且使用MEF或STO对建系效率没有显著影响。(2)LCDM培养体系可获得具有一定多能性的猪胚胎干细胞系。(3)在LCDM体系下抑制TGFβ信号通路可有效提高猪多能性细胞系核心转录因子的表达,并促进细胞增殖。(4)基因表达图谱分析表明,ICM向猪多能性细胞转变过程中的ICMs、BOs和PSCs转录组具有较大差异。并且在ICM到pPSCs过程中,涉及到的MAPK,JAK/STAT,TGFβ以及WNT等信号通路可能是影响猪胚胎干细胞系建立及多能性的关键信号通路。
Abstract
pei tai gan xi bao (Embryonic Stem Cells,ESCs)shi yi chong yi lai yu yi ding de ti wai tiao jian ,neng gou wen ding de zi wo geng xin ,bing bao chi duo neng xing de xi bao lei xing ,yi ban lai yuan yu zhi ru qian nang pei de nei xi bao tuan (Inner Cell Mass,ICM)。zhong suo zhou zhi pei tai gan xi bao ju you neng gou mo xian ji zeng shi de neng li ,bing ju ke yi fen hua wei cheng ti suo you lei xing de xi bao ,zhe shi de ta men dui yao wu kai fa he zai sheng yi xue de yan jiu ju you te bie chong yao de jia zhi 。bu tong zhuang tai de pei tai gan xi bao ju you bu tong de duo neng xing te zheng :Na?veduo neng xing zhuang tai ,ju you quan mian de fen hua qian neng he qian ge ti gong suo neng li ,yi xiao shu pei tai gan xi bao wei dai biao ;Primedduo neng xing zhuang tai ,ju you shou xian de fen hua neng li he qian ge ti gong suo neng li ,yi ren lei huo ling chang lei pei tai gan xi bao wei dai biao 。er zai ji ta da dong wu li ru zhu deng wu chong zhong ,Na?veduo neng xing zhuang tai de pei tai gan xi bao reng ran wei neng cheng gong huo de 。di yi zhu xiao shu pei tai gan xi bao ji zai han you tai niu xie qing (Fetal Bovine Serum,FBS)he si yang ceng xi bao de tiao jian xia jian li ,hai you yi chong fang shi shi tong guo tian jia bai xie bing yi zhi yin zi (Leukemia Inhibitory Factor,LIF)lai cu jin xiao shu pei tai gan xi bao ji de jian li 。ran er ,zai yi shang tiao jian xia ,zhi you 129/SVpin ji de xiao shu pei tai neng gou you xiao de jian li qi pei tai gan xi bao ji ,er ji ta da duo shu pin ji de xiao shu pei tai gan xi bao ji de jian li reng ran cun zai kun nan 。zhi dao 2008nian ,ren men li yong han you MEKhe GSK3yi zhi ji de 2ipei yang ti ji ,cong hu duo ji ta tong chang bei ren wei mo fa cheng gong huo de gan xi bao ji de xiao shu pin ji zhong jian li le pei tai gan xi bao ji 。tong shi ,li yong gai ti ji ye ke cheng gong cong da shu pei tai pei yang huo de da shu pei tai gan xi bao ji 。ci wai ,tong guo shai shua neng gou wei chi OCT4yuan duan zeng jiang zi huo xing de yin zi ,jian li le han LIF、Activin Ahe 5chong bu tong ji mei yi zhi ji de 5i/L/Apei yang ti ji ,gai ti ji ke zhi chi ren Na?vepei tai gan xi bao de zi wo geng xin ,bing neng gou jiang Primedzhuang tai de ren pei tai gan xi bao zhuai hua wei Na?veduo neng xing zhuang tai 。ran er ,zhe xie ti ji shi hu dui xiao shu huo ren yi wai de ji ta wu chong de Na?veduo neng xing pei tai gan xi bao de jian li mei you xiao guo 。2017nian ,tong guo hua xue shai shua ,jian li le yi chong tian jia le human LIF、CHR99021、(S)-(+)-dimethindene maleate(DiM)he minocycline hydrochloride(MiH)de pei yang ji ,chen wei LCDM,gai tiao jian xia ke tong shi cong ren he xiao shu pei tai huo de ju you can yu pei tai he pei wai zu zhi qian ge ti fa yo neng li de duo neng xing gan xi bao ji ,zhe xie xi bao bei chen wei kuo zhan duo neng gan (Extended Pluripotent Stem,EPS)xi bao ,ci yan jiu kai bi le cong bu tong bu ru dong wu jian li ju you qian ge ti neng li de duo neng gan xi bao de tu jing 。zhu bu jin shi zhu yao de rou shi lai yuan dong wu ,er ju zai dai xie 、mian yi he sheng li shang yu ren lei fei chang xiang shi ,shi sheng wu yi xue yan jiu li xiang de dong wu mo xing ,ci wai you yu ji qi guan yu ren lei qi guan da xiao xiang jin ,zhu ye shi yi chong qi guan yi zhi de qian zai gong ti 。yin ci ,zhu duo neng gan xi bao (porcine Pluripotent Stem Cells,pPSCs)de jian li yu pei yang yi cheng wei ke xue jia men de yan jiu re dian 。ran er ,mu qian yi fa biao de zhu duo neng gan xi bao ji dou bei zheng ming shi lei pei tai gan xi bao ji ,zhe xie xi bao ji da duo biao xian chu you xian de duo neng xing te zheng ,mo fa xing cheng ji tai liu huo sheng shi ji qian ge ti 。yin ci ,zhen zheng de zhu duo neng gan xi bao ji de jian li yu huo de shi shi fen zhi de ji dai de 。wei le cong zhu pei tai zhong jian li duo neng gan xi bao ren men yi jing zuo le hu duo nu li 。sui ran shang wei huo de zhen zheng de zhu pei tai gan xi bao ji ,dan yi cong ge chong bu tong lai yuan de zhu pei tai zhong jian li huo de le hu duo jia ding de zhu duo neng xing gan xi bao ji 。ran er ,yu xiao shu pei tai gan xi bao xiang bi ,zhe ji zhong da duo shu xi bao ji de duo neng xing dou cha jiang ren yi ,ju ti biao xian wei zhe xie zhu duo neng gan xi bao zhu ru luo shu pi xia mo fa ji tai liu huo zhe qian ge hou bu neng can yu dao sheng shi ji de fa yo zhong 。xian qian de yan jiu biao ming ,bu tong lai yuan de zhu pei tai gan xi bao ji biao xian chu ke long xing tai bian ping de te zheng ,bing ju ji ti wai he ti nei de fen hua neng li you xian 。ta men zai xi bao duo neng xing fen lei shang shu yu Primedzhuang tai ,er fei Na?vezhuang tai 。ju ci ,ben yan jiu cai yong zhu ti nei 6.5tian nang pei ,li yong LCDMti ji ,chang shi jian li zhu duo neng xing gan xi bao ,bing tong guo xiao yang ben gao tong liang ce xu fen xi LCDMti ji huo de de zhu duo neng xing xi bao ji xiao shu 、ren EPSxi bao zhong duo neng xing ji yin biao da mo shi he xiang guan xin hao tong lu huo xing zhuang tai 。wo men huo de de jie guo biao ming :(1)zai bu tong ti ji xia li yong zhu ti nei pei tai jian li de duo neng xing gan xi bao ji jun qu de jiao hao de xiao guo 。ji zhong KOFLpei yang ti ji xia ,zai jie chong 2mei zhu ti nei pei tai de qing kuang xia cheng gong huo de le 1zhu zhu duo neng gan xi bao ji PeNK6,huo de de xi bao ke long xing tai yu ren pei tai gan xi bao xiang shi ,cheng xian chu yi chong bian ping de chan ceng xi bao de zhuang tai ,jian xing lin suan mei (AP)jian ce de jie guo biao ming gai xi bao ji cheng yang xing de jie guo ,ji gai xi bao ji ju you duo neng xing xi bao de ji ben te zheng ,mian yi ying guang jian ce biao da he xin zhuai lu yin zi OCT4,SOX2,NANOG,ding liang PCRjian ce he xin zhuai lu yin zi de biao da jie guo yu mian yi ying guang jie guo xiang yi zhi 。(2)zai LCDMpei yang ti ji xia ,cai yong MEFhuo STOzuo wei si yang ceng ,dui zhu duo neng xing gan xi bao jian ji xiao lv bu cun zai ming xian de cha bie 。huo de zhu duo neng gan xi bao ji ,ke long xing tai cheng bian ping zhuang ,dan geng jia jin mi ,cheng APyang xing ,biao da he xin zhuai lu yin zi OCT4,SOX2,NANOG,tong shi xi bao hai biao da SSEA3he SSEA4。ju you ti wai fen hua de neng li 。(3)huo de de xi bao ji jin hang le xiao yang ben gao tong liang ce xu fen xi ,dui xiao shu ,ren he zhu san ge wu chong huo de de EPS/PSCzhong Na?vehe Primedxiang guan ji yin de biao da jin hang le bi jiao fen xi ,fa xian xiao shu ,ren he zhu zhong LCDMti ji xia jian li de EPSxi bao huo PSCsbing bu tong yu ESCsxi bao huo ICMxi bao de duo neng xing te zheng ,sui ran dou hui you he xin zhuai lu yin zi de biao da ,dan bu fen Na?vehe Primedxiang guan ji yin de biao da hai shi hui cun zai cha yi 。ci wai ,dui duo neng xing xin hao tong lu ji huo qing kuang ye jin hang le bi jiao fen xi ,jie guo xian shi zai LCDMpei yang ti ji zhong zhu duo neng xing gan xi bao zhong TGFβxin hao tong lu chu yu gao huo xing zhuang tai ,zhe ke neng shi ying xiang gai ti ji xia huo de zhu duo neng xing gan xi bao ji duo neng xing de yuan yin zhi yi 。ju ci ,wo men zai LCDMpei yang ji zhong tian jia TGFβxin hao tong lu yi zhi ji SB431542。jie guo xian shi ,yu pPSC-LCDMxi bao ji xiang bi you hua ti ji pei yang de xi bao bu jin he xin zhuai lu yin zi de biao da you suo di gao ,xi bao de zeng shi neng li ye xian zhe xing zeng jiang 。jin yi bu ,tong guo xiao yang ben gao tong liang ce xu ,wo men jian li le ICMxiang pPSC-LCDMszhuai bian guo cheng zhong de ji yin biao da tu pu 。jie guo xian shi ICMs,BOs(blastocyst outgrowths)he PSCsde zhuai lu zu ju you jiao da cha yi ,zai pei tai jie chong hou di 1tian ,zhuai lu zu ji fa sheng jiao da bian hua 。jie guo xian shi ICMs,BOshe PSCsde zhuai lu zu ju you jiao da cha yi ,ju BO5shi huo de duo neng xing gan xi bao guo cheng zhong duo neng xing bian hua de guan jian zhuai she dian 。tong guo yi shang de jie guo ,wo men huo de yi xia jie lun :(1)zai LCDMti ji xia ,li yong zhu ti nei pei tai jian li zhu duo neng xing gan xi bao ji de xiao lv jiao gao ,jian ji xiao lv ke da 50%zuo you ,er ju shi yong MEFhuo STOdui jian ji xiao lv mei you xian zhe ying xiang 。(2)LCDMpei yang ti ji ke huo de ju you yi ding duo neng xing de zhu pei tai gan xi bao ji 。(3)zai LCDMti ji xia yi zhi TGFβxin hao tong lu ke you xiao di gao zhu duo neng xing xi bao ji he xin zhuai lu yin zi de biao da ,bing cu jin xi bao zeng shi 。(4)ji yin biao da tu pu fen xi biao ming ,ICMxiang zhu duo neng xing xi bao zhuai bian guo cheng zhong de ICMs、BOshe PSCszhuai lu zu ju you jiao da cha yi 。bing ju zai ICMdao pPSCsguo cheng zhong ,she ji dao de MAPK,JAK/STAT,TGFβyi ji WNTdeng xin hao tong lu ke neng shi ying xiang zhu pei tai gan xi bao ji jian li ji duo neng xing de guan jian xin hao tong lu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自东北农业大学的张雪，发表于刊物东北农业大学2019-08-27论文，是一篇关于小样本高通量测序论文,多能性论文,东北农业大学2019-08-27论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自东北农业大学2019-08-27论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。