脐带间质干细胞的功能及转基因抗肿瘤的研究

论文摘要

目的探讨人脐带间质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC）的分离培养及其生物学特性。开展hUCMSC慢病毒转基因抗肿瘤的初步研究。方法采用组织块贴壁培养方法获得hUCMSC，并对其进行体外培养，应用PKH26和二咪基苯基吲哚（DAPI）染色方法进行形态学观察；应用流式细胞术测定细胞周期及表面抗原特征FITC-CD34，CD71，HLA-DR，PE-CD29，CD38，CD44，CD105和HLA-Ⅰ；染色体遗传分析及绘制生长曲线；利用地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、bFGF和地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、消炎痛诱导第3代hUCMSC分别向成骨细胞和脂肪细胞分化，并通过碱性磷酸酶（ALP）、Von Kossa和油红O染色进行检测；通过PCR，RT-PCR等方法检测相关基因的表达。构建融合基因TNFα-Tumstatin的慢病毒载体，采用磷酸钙转染方法转染293T细胞和hUCMSC，通过PCR，RT-PCR，ELISA，3H-TdR检测融合基因及其蛋白的表达，观察抑制肿瘤生长的效果。结果hUCMSC在培养了两周后，大多呈纤维状生长，细胞传至第2代时，则为均一的长梭形细胞。在经PKH26和DAPI染色后，可见细胞有一个蓝色的平滑的核，胞浆呈红色，并可维持20天左右。在传代4个月后（约26代），细胞仍然保持了其生物学特性。流式分析显示：CD29，CD44，CD95，CD105，HLA-Ⅰ表达阳性，CD34，CD38，CD71，HLA-DR不表达。染色体核型正常。第3代细胞周期分析显示：G0／G1，G2／M和S期分别为88.86％，5.69％和5.45％。经过体外诱导，ALP、Von Kossa和油红O染色均呈不同程度的阳性，RT-PCR结果显示，诱导后的细胞分别表达了骨形成蛋白-3（BMP-3）和过氧化物酶体增殖体激活受体γ2（PPARγ2）等基因。hUCMSC还表达了骨髓MSC所表达的BMI-1和nucleostemin基因。成功构建融合基因TNFα-Tumstatin的慢病毒载体，包装293T细胞后可见绿色荧光，转染效率可达50％以上，在转化293T和hUCMSC后，基因组中可检测到融合基因，表明转染成功。慢病毒上清中可以检测到融合蛋白的表达并且对肿瘤细胞U937（人髓系白血病细胞株）具有抑制作用。结论HUCMSC具有与骨髓MSC相似的生物学特性，尤其具有向成骨细胞和成脂肪细胞分化的多潜能性特点。hUCMSC的慢病毒转基因抗肿瘤的研究已取得初步进展，在转基因治疗肿瘤中具有重要的前景，将成为基因治疗和组织工程中一种新的间质干细胞来源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 间质干细胞的来源及其生物学特性
• 1.1.1 间质干细胞
• 1.1.2 MSC的来源
• 1.1.3 MSC的形态学特征
• 1.1.4 MSC的生物学特性分析
• 1.1.4.1 MSC的数量
• 1.1.4.2 MSC的增殖能力
• 1.1.4.3 MSC的细胞表面标志
• 1.1.4.4 MSC的多向分化潜能
• 1.2 MSC的基因治疗
• 1.2.1 基因治疗的原则
• 1.2.2 目的基因
• 1.2.3 基因载体
• 1.2.4 基因治疗的靶细胞
• 1.2.5 MSC的基因治疗
• 1.2.6 MSC的基因治疗的展望
• 1.2.6.1 MSC的基因治疗的安全性问题
• 1.2.6.2 靶细胞生物学特性
• 1.2.6.3 治疗基因的问题
• 1.2.6.4 基因表达的可调控性
• 1.2.6.5 外源基因长期稳定表达的问题
• 第二章 本论文研究的目的、方法、实验方案的设计、意义
• 2.1 研究目的
• 2.2 研究方法及技术
• 2.3 实验方案的设计
• 2.4 本研究的意义
• 第三章 脐带间质干细胞的分离纯化及生物学特性研究
• 3.1 材料和仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 人脐带MSC的分离扩增
• 3.2.2 形态学分析
• 3.2.3 MSC表面标志的检测
• 3.2.4 MSC生长曲线的测定
• 3.2.5 MSC周期检测及染色体核型分析
• 3.2.6 MSC诱导分化成骨细胞与脂肪细胞的细胞化学染色
• 3.2.7 总RNA提取和逆转录
• 3.3 结果
• 3.3.1 人脐带MSC的分离培养和表面标志
• 3.3.2 MSC的生长特性
• 3.3.3 MSC细胞周期与染色体核型检测
• 3.3.4 MSC向成骨及脂肪细胞的分化
• 3.3.5 MSC特异性基因的表达
• 3.4 讨论
• 第四章 融合基因TNF α-Tumstatin的慢病毒载体构建及基于脐带间质干细胞的基因治疗
• 4.1 材料和仪器
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 融合基因TNF α-Tumstatin的设计及慢病毒载体的构建
• 4.2.3 融合基因的慢病毒包装
• 4.2.4 慢病毒转化293T和脐带间质干细胞
• 4.2.5 PCR
• 4.2.6 ELISA检测融合蛋白
• 3H-TdR检测293T细胞包装后上清对肿瘤细胞U937的杀伤作用'>4.2.7³H-TdR检测293T细胞包装后上清对肿瘤细胞U937的杀伤作用
• 4.3 结果
• 4.3.1 融合基因TNF α-Tumstatin的慢病毒载体构建
• 4.3.2 慢病毒的包装
• 4.3.3 转化的细胞基因组中融合基因的检测
• 4.3.4 ELISA检测融合蛋白
• 4.3.5 293T细胞包装后病毒上清对肿瘤细胞U937的杀伤作用
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的文章及获奖