转AGD2和CTB基因小麦的研究

论文摘要

小麦赤霉病可给小麦生产造成严重损失,由于天然抗源匮乏,抗赤霉病育种进展缓慢,使通过转基因技术来改良小麦赤霉病抗性成为研究热点。人类Ⅰ型糖尿病是一种器官特异性自身免疫疾病,目前主要通过注射胰岛素来控制高血糖,多肽p277是Ⅰ型糖尿病发生的一种自身抗原,可作为Ⅰ型糖尿病疫苗,共表达霍乱毒素B亚基CTB可以增强p277的免疫原性。由禽流感病毒引发的禽流感是一种禽类传染病,其表面抗原基因M1、M2、NA和HA可以用来生产疫苗,但现有医用疫苗成本高、有副作用。因此,利用转基因小麦作为绿色生物反应器,生产以种子为载体的糖尿病疫苗和禽流感疫苗,将为糖尿病和禽流感防治开辟一条新途径；而表达抗赤霉病AGD2基因,可为培育抗病新品种提供材料。本研究采用基因枪法,将AGD2基因,p277与CTB融合基因分别转入小麦,通过PCR鉴定已获得转基因植株。还分析研究了实验室已获得的转禽流感表面抗原基因小麦株系。主要结果如下：（1）将抗菌肽与抗体融合基因AGD2成功转入小麦品种郑麦9023,PCR鉴定获得T0代转基因小麦6株,目的基因可稳定遗传给子代；（2）根据植物密码子偏爱性优化CTB和p277核酸序列,添加植物信号肽、内质网驻留信号KDEL、His-tag标签和限制性内切酶位点,人工合成576 bp融合基因,并构建到单子叶植物种子特异表达载体中；（3）将CTB-p277融合基因成功转入扬麦158和扬麦15,PCR鉴定获得T0代转基因小麦10株,其中以扬麦158为受体,转CTB-3x-p277靶向蛋白体组合6株,CTB-p277靶向内质网组合3株；以扬麦15为受体,转CTB-p277靶向蛋白体1株；（4）PCR鉴定了本实验室已获得的转禽流感表面抗原基因小麦株系,结果表明,T2和T3代转基因小麦中目的基因多为连锁遗传,后代分离不符合3：1比例；筛选获得稳定遗传、同时含有4个基因M1、M2、NA和HA的转基因株系6个,含3个基因M2、NA和HA的转基因株系5个。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1 研究背景
• 1.1 基因枪技术转化小麦的研究进展
• 1.1.1 Bar筛选标记基因的研究进展
• 1.1.2 PMI筛选标记基因的研究进展
• 1.2 小麦抗赤霉病基因工程研究进展
• 1.3 糖尿病疫苗的研究概况
• 1.3.1 Ⅰ型糖尿病的发病机制
• 1.3.2 口服耐受
• 1.3.3 免疫佐剂霍乱毒素B亚基的研究进展
• 1.4 禽流感疫苗研究进展
• 1.5 植物生物反应器研究进展
• 1.6 提高外源基因表达的策略
• 2 研究目的及意义
• 第二章 相关载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 菌株及质粒
• 1.1.2 酶及试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 PCR扩增引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 质粒DNA的提取
• 1.2.2 DNA片段回收
• 1.2.3 大肠杆菌DH 5α感受态细胞热击转化
• 1.2.4 PCR扩增体系及程序
• 2 结果与分析
• 2.1 AGD2最小表达框的制备
• 2.2 pBar-LYA-CTB和pLYA-CTB植物表达载体的构建
• 2.3 用于基因枪轰击的转化品种和转化组合
• 第三章 基因枪介导的小麦幼胚转化
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 质粒及最小表达框
• 1.1.2 转化受体
• 1.1.3 培养基及试剂
• 1.1.4 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 幼胚的接种和培养
• 1.2.2 高渗处理及基因枪轰击
• 1.2.3 恢复培养及筛选
• 1.2.4 生根壮苗、春化及移栽
• 1.2.5 DNA的提取
• 1.2.6 PCR扩增
• 1代材料的萌发'>1.2.7 T₁代材料的萌发
• 1代材料的RNA提取'>1.2.8 T₁代材料的RNA提取
• 1.2.9 RT-PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 小麦幼胚转化及转基因植株的获得
• 2.2 不同品种小麦幼胚愈伤转化结果的比较
• 2.3 不同筛选剂对小麦再生植株的影响
• 2.4 不同培养基组分对转基因小麦生根的影响
• 2.5 转基因植株的PCR鉴定
• 2.5.1 转AGD2基因小麦的PCR鉴定
• 2.5.2 转CTB基因小麦的PCR鉴定
• 1代材料的RT-PCR鉴定'>2.6 部分T₁代材料的RT-PCR鉴定
• 3 讨论
• 第四章 转禽流感表面抗原基因小麦的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 转基因小麦材料
• 1.1.2 小麦基因组DNA和RNA提取试剂
• 1.1.3 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 转基因植株的PCR鉴定
• 1.2.2 小麦未成熟籽粒RNA的提取
• 1.2.3 小麦常规杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因植株后代的PCR鉴定
• 2.2 转基因植株后代的分离情况分析
• 2.3 转基因植株后代的RT-PCR鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢