抗旱、耐盐基因P5CS转化向日葵自交系

论文摘要

本论文利用基因工程手段通过农杆菌介导法将抗旱、耐盐基因P5CS转化到向日葵中，并成功获得了PCR-Southern杂交检测为阳性的转基因植株，为向日葵的抗旱、耐盐育种研究提供新的试验依据。主要研究内容与结果如下：1、通过PCR对载体pBIP5CS-F129A进行特异性扩增，获得了目的基因P5CS（1905bp）并对其进行克隆。利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ将目的基因从克隆重组质粒消化下来，定向插入到植物表达载体pCHF3的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游，成功地构建了P5CS基因植物表达载体pCHF3／P5CS，通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中，提取转化质粒，经PCR鉴定表明P5CS基因植物表达双元载体构建成功。2、以向日葵保持系75-33B和恢复系Ht80-97为转化受体材料，用携带P5CS基因的双元载体系统的根癌农杆菌进行叶盘转化，获得抗Kan的转基因植株。对转化植株总DNA进行PCR检测，以表达载体重组质粒pCHF3／P5CS的PCR产物为阳性对照，以非转基因向日葵基因组PCR产物为阴性对照，对转基因向日葵基因组进行PCR-Southern杂交检测，证实获得阳性转基因植株75-33B为2株，Ht80-97为4株，转化率分别是3.17％和4.65％。3、试验中对抗性芽筛选的Kan浓度设定为25mg／L，农杆菌的侵染浓度OD600nm值为0.8，通过设定三个不同侵染时间（10min、20min和30min）的处理，结果经分析发现，农杆菌侵染叶盘30min有助于外植体再生芽的分化，有利于提高转化率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 抗旱、耐盐碱基因研究进展
• 1.1.1 抗氧化酶基因
• 1.1.2 水分胁迫蛋白基因
• 1.1.3 转录因子基因
• 1.1.4 渗透调节保护基因
• 1.1.4.1 多元醇类合成相关基因
• 1.1.4.2 糖类合成相关基因
• 1.1.4.3 氨基酸及其衍生物合成相关基因
• 1.1.5 脯氨酸及其合成的关键酶基因P5CS
• 1.2 向日葵遗传转化研究进展
• 1.2.1 农杆菌介导的向日葵遗传转化法
• 1.2.2 PEG介导的转化方法
• 1.2.3 基因枪遗传转化法
• 1.2.4 显微注射和花粉管通道法
• 1.3 课题研究的目的和意义
• 2 P5CS基因的克隆与植物表达载体的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 酶及主要试剂
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的基因的克隆
• 2.2.1.1 碱裂解法小量提取pBIP5CS-F129A质粒
• 2.2.1.2 P5CS基因片段的扩增
• 2.2.1.3 目的片段与克隆载体的连接
• 2.2.1.4 E.coli Top10感受态细胞的转化
• 2.2.1.5 重组质粒阳性克隆的检测
• 2.2.1.6 目的基因片段插入方向的鉴定
• 2.2.2 P5CS基因植物表达载体的构建
• 2.2.2.1 农杆菌LBA4404感受态细胞的制备
• 2.2.2.2 目的片段的回收
• 2.2.2.3 LBA4404感受态细胞的转化
• 2.2.2.4 重组质粒检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 P5CS基因全长片段的扩增
• 2.3.2 P5CS基因的克隆及其检测
• 2.3.2.1 P5CS基因克隆
• 2.3.2.2 目的基因序列测定
• 2.3.2.3 P5CS基因插入方向的鉴定
• 2.3.3 P5CS基因植物表达载体的构建
• 2.3.3.1 表达载体的选择
• 2.3.3.2 植物表达载体的构建及其检测
• 2.4 讨论
• 3 农杆菌介导法转化向日葵
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 载体与菌株
• 3.1.3 主要生化试剂
• 3.1.4 培养基及其配方
• 3.2 方法
• 3.2.1 向日葵转化试验
• 3.2.1.1 受体材料的准备
• 3.2.1.2 侵染菌液的制备
• 3.2.1.3 叶盘的转化
• 3.2.1.4 转化体筛选和植株再生
• 3.2.2 转化体鉴定
• 3.2.2.1 植物总DNA的提取
• 3.2.2.2 目的基因的PCR扩增
• 3.2.2.3 PCR-Southern杂交检测
• 3.2.2.4 探针制备
• 3.2.2.5 凝胶转膜
• 3.2.2.6 杂交
• 3.2.2.7 洗膜
• 3.2.2.8 免疫检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 向日葵叶盘的转化及抗性植株的再生
• 3.3.2 受体基因型和侵染时间对叶盘芽分化的影响
• 3.3.3 转化植株的PCR检测
• 3.3.4 PCR-Southern杂交检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 抗生素浓度和农杆菌侵染外植体时间对转化效率的影响
• 3.4.2 试管内开花问题
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介