SIRT1基因与脂肪细胞胰岛素受体的关系

论文摘要

背景与目的随着经济与社会发展,人类饮食生活习惯的变化,肥胖及2型糖尿病的发病率在逐年升高,因此关于糖尿病及肥胖症的研究现已成为生物学及医学领域研究的热点问题。目前对糖尿病的发病机制的认识已经不单纯停留在体内胰岛素缺乏的水平上,越来越多的研究证明,肥胖及其他因素造成的胰岛素抵抗在糖尿病的发病中起着越来越重要的作用。胰岛素是哺乳动物体内促进葡萄糖进入细胞内的唯一激素,胰岛素缺乏或者因抵抗导致的胰岛素不敏感在糖尿病发生中起重要作用。现已知胰岛素在体内要通过以下步骤发挥作用:胰岛素到达相应的靶细胞以后,与靶细胞膜表面的胰岛素受体（insulin receptor,INSR）的α亚基结合,激活β亚基,导致受体自动磷酸化,从而引起胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate,IRS）的酪氨酸磷酸化,磷酸化的IRS-1可激活磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）,引起PI3K的活性升高,最终促进糖的转运活动以及胰岛素的其他功能。在八十年代发现的沉默信息调节因子2（Silent information regulator 2,Sir 2）是一个重要的调节基因,可以延长相当多物种的寿命,它是与基因沉默及rDNA重组维持基因稳定性相关的重要基因,具有组蛋白去乙酰化活性。在哺乳动物中Sir 2有7个同源基因,分别命名为SIRT1-SIRT7,它们在细胞周期调控、DNA损伤修复、抑制细胞凋亡及延长细胞寿命等方面都发挥着重要作用。近年来发现SIRT1在脂代谢、糖代谢、心血管疾病及肿瘤发生发展中也起着重要作用。现已知SIRT1可作用于胰岛素/胰岛素样生长因子-1（Insulin/IGF-1）信号通路中的FOXO、IRS-1、PI3K/Akt及脂肪特异性基因PPARγ等,从而改善胰岛素信号传导,参与糖脂代谢调控。那么SIRT1是否可以作用于Insulin/IGF-1信号通路最上游基因——胰岛素受体基因呢?是否可以调节胰岛素受体蛋白的数目及亲和力,从而控制整个糖代谢通路呢?我们推断,在SIRT1与脂肪细胞胰岛素受体之间应该存在着某种联系,SIRT1很可能通过作用于脂肪细胞胰岛素通路Insulin/IGF-1最上游胰岛素受体基因,调节脂肪细胞表面胰岛素受体蛋白的表达,从而参与糖代谢的调控。本实验将通过腺病毒转染诱导分化后的3T3-L1细胞来研究SIRT1基因对脂肪细胞胰岛素受体基因及蛋白表达的影响,从分子水平上研究糖尿病发生发展的机制,为进一步探索胰岛素抵抗的机制及治疗作了铺垫。材料与方法采用国际公认的前脂肪细胞系3T3-L1为研究对象,在一定条件下将其诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。用Ad-mSirt1-IRES-eGFP腺病毒转染脂肪细胞,使其SIRT1基因高表达,检测INSR基因及蛋白表达情况。实验分2组:（1）阴性对照组（2）Ad-mSirt1-IRES-eGFP腺病毒转染组。收集两组细胞,分别提取总RNA,定量PCR检测INSR基因和SIRT1基因的表达情况。并用免疫荧光细胞化学染色、Western blot检测两组细胞中胰岛素受体及SIRT1蛋白的表达情况。结果1、免疫荧光细胞化学染色结果显示,与对照组相比,转染组SIRT1蛋白及INSR蛋白表达均较对照组增加。2、Western blot结果显示,与对照组相比,转染组SIRT1蛋白及INSR蛋白表达均较对照组增加。3、Q-PCR结果显示,与对照组相比,转染组SIRT1基因有明显上调;INSR明显下调（可能由于Q-PCR实验结果不准确）。结论上调由前脂肪细胞系3T3-L1分化成熟的脂肪细胞的SIRT1基因表达可影响其INSR的基因及蛋白表达。本实验显示,与对照组相比,转染组INSR基因mRNA水平下降,但蛋白水平升高。此处mRNA与蛋白表达水平不一致,可能因实验操作有误导致Q-PCR结果不精确有关;而WB结果通常较为可靠,且WB能显示最终蛋白表达情况,也与本实验中免疫荧光细胞化学染色结果及我们的预期结果相一致,故我们采用WB结果。以此推论,SIRT1可以上调脂肪细胞胰岛素受体蛋白水平的表达,从而提高胰岛素敏感性,减轻胰岛素抵抗,延缓2型糖尿病的发生发展。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株及腺病毒
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 3T3-L1 细胞培养
• 2.2.2 3T3-L1 细胞成脂诱导分化
• 2.2.3 油红染色
• 2.2.4 病毒转染
• 2.2.5 细胞总RNA 提取
• 2.2.6 定量PCR
• 2.2.7 免疫荧光法
• 2.2.8 Western Blot
• 第三章 实验结果
• 3.1 细胞培养
• 3.2 细胞诱导分化及油红染色
• 3.3 转染
• 3.4 定量PCR
• 3.5 免疫荧光
• 3.6 Western blot 蛋白定量
• 3.6.1 蛋白定量结果（见表3.6.1.2）
• 3.6.2 Western Blot 电泳结果（见图3.6.2）
• 第四章 讨论
• 4.1 脂肪细胞的培养进展
• 4.2 脂肪细胞在诱导分化过程中自身发生的生物学改变
• 4.3 体外诱导分化的成熟脂肪细胞其生物学特性与体内正常脂肪细胞相比是否发生改变？
• 4.4 SIRT1 在insulin/IGF-1 通路中的调控
• 4.5 SIRT1 在脂肪细胞中的调控
• 4.6 糖脂代谢通路的交叉及SIRT1 在其中的作用靶点
• 4.7 本实验的设计思路
• 4.8 关于实验结果的分析
• 第五章 结论
• 第六章 本研究存在的问题及进一步设计方案
• 参考文献
• 附文一：综述
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间完成的论文
• 个人简历