水稻逆境相关转录因子的分离和功能鉴定

论文摘要

干旱、冷害和盐碱等非生物逆境对于作物的产量和品质有着非常重要的影响。干旱是植物逆境最普遍的形式，在许多地区是农业发展的瓶颈。因而抗逆育种特别是抗旱育种一直受到重视。虽然有很多报道认为超量表达某些基因可以提高转基因植株的抗逆性，但真正用于大田实验或在作物中尝试的少之又少。本研究以最终获得用于水稻抗逆遗传改良的基因为目的，通过超量表达一些对逆境起核心调控作用的转录因子，系统地对这些转基因水稻在大田和温室环境中进行抗逆性分析和鉴定，初步鉴定出SNAC1和SNAC2等基因在抗逆遗传改良中的有效性，并对这两个基因进行了深入的功能研究和抗逆性机制探讨。主要结果如下：1．在载体pCAMBIA1301S（含double CaMV 35S启动子），pCAMBIA1301A（含Actin1启动子），pCAMBIA1301U（含Ubiquitinl启动子）和pCAMBIA1301H（含HVA1-like干旱诱导启动子）的基础上，构建了43个目标基因超量表达载体和1个诱导表达载体；在载体pHELLSGATE2的基础上，构建了32个目标基因的RNA干扰（RNAi）抑制表达载体。2．通过northern和Southern杂交对转基因植株进行了表达量的检测和转基因拷贝数的检测，结果表明大概有50％左右的植株为超量表达，30％左右的植株为单拷贝转基因插入。3．通过田间对苗期转基因水稻的干旱筛选，筛选出4个目标基因的转基因家系干旱敏感和5个目标基因的转基因家系表现为抗旱增强。4．通过田间对成株期转基因水稻的干旱筛选，筛选出4个目标基因的转基因部分家系抗旱性明显增强。综合抗旱筛选结果，详细鉴定了SNAC1的功能；同时对另外两个基因（SNAC2和T052）的功能进行初步分析。5．对SNAC1基因的表达谱分析，表明SNAC1受干旱、高盐、低温和ABA的诱导表达，并且在干旱条件下，SNAC1在保卫细胞特异诱导表达。6．酵母细胞中的反式激活和单杂交实验以及亚细胞定位结果表明SNAC1具有NAC（NAM，ATAF and CUC2）转录因子的特性，其中241-271位的氨基酸序列对于SNAC1具有转录激活功能是必不可少的，同时SNAC1能结合具有CACG和CATGTG核心序列（类似于拟南芥中鉴定的NACRS序列）的顺式作用元件，并促进报告基因的表达。7．SNAC1超量表达转基因植株在成株期和苗期的抗旱性明显增强。特别是在重度干旱条件下，野生型植株的结实率低于5％，而转基因水稻的结实率在20％以上。但是转基因与野生型植株的表型没有任何差异。8．扫描电镜观察结果表明转基因植株的气孔关闭数要显著高于野生型植株；在干旱过程中，转基因植株丧失水分的速率要慢于野生型，具有更低的临界相对含水量。9．无论是个体水平还是细胞水平，SNAC1的超量表达能提高转基因水稻的耐盐性。10．SNAC1的超量表达引起转基因水稻植株的ABA敏感性。11．SNAC1超量表达的转基因水稻植株进行基因表达谱分析，发现有很多与气孔运动、渗透调节、细胞膜稳定性、脱毒作用等相关的基因都上升表达。12．T052基因（编码MYB类转录因子）也受非生物逆境的诱导表达，但在水稻和早稻之间存在表达量的差异；与GFP的融合基因的表达谱分析表明T052也在保卫细胞中表达。13．SNAC1蛋白与T052启动子的互作，它们在保卫细胞的表达模式以及SNAC1转基因植株的基因表达谱分析等结果表明T052可能是SNAC1的下游调控基因，SNAC1和T052在调控气孔关闭中可能起着重要作用。14．SNAC2也具有转录激活、DNA结合和定位在细胞核等转录因子所通常具有的特性。它不仅受非生物逆境（干旱、高盐、低温和ABA）的诱导表达，同时还受JA和伤害的诱导表达。15．SNAC2在水稻中超量表达或诱导表达后能提高转基因植株的耐盐性和耐冷性，同时也大大提高了对ABA的敏感性。16．考虑到SNAC1的潜在应用价值，本研究进一步构建了两个应用型的遗传转化载体pSMDP01和pSMDP01。载体中将SNAC1作为筛选标记基因，利用具有双向诱导活性的启动子OCPI1P来驱动筛选标记基因和抗逆基因（或同时控制多个抗逆基因）的同时表达。

论文目录

• 缩写名词表
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物在非生物逆境下的应答反应
• 1.2 不同逆境下植物的生理变化和抗逆性评价
• 1.3 转录因子研究概况
• 1.3.1 转录因子概念及结构特征
• 1.3.2 转录因子的分类及功能
• 1.3.3 与逆境相关的转录因子的研究进展
• 1.3.3.1 AP2/EREBP
• 1.3.3.2 bZIP转录因子
• 1.3.3.3 Zinc finger转录因子
• 1.3.3.4 MYB/MYC转录因子
• 1.3.3.5 NAC转录因子
• 1.4 转录因子在逆境抗性基因工程中的应用
• 1.5 植物基因功能研究策略
• 1.5.1 基因功能丧失方法（Loss of function）
• 1.5.1.1 反义抑制和共抑制
• 1.5.1.2 插入突变
• 1.5.1.3 RNA干扰（RNAi）
• 1.5.2 基因功能增加方法
• 1.5.2.1 超量表达（Over-expression）
• 1.5.2.2 基因诱导表达（Inducible expression）
• 1.5.3 DNA Microarray
• 1.5.4 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）
• 1.6 选择标记基因在转基因植物中的研究进展
• 1.6.1 农杆菌介导的遗传转化系统和抗性标记基因的使用
• 1.6.2 现有抗性标记基因的不足
• 1.6.3 无标记筛选转基因植株的技术
• 1.6.4 安全标记基因的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 水稻材料
• 2.2 用于遗传转化的水稻基因片段
• 2.3 实验所用到的菌株、质粒、载体和感受态细胞
• 2.4 DNA的抽提和Southern杂交
• 2.5 RNA的抽提,反转录和Northern杂交
• 2.6 水稻内源基因表达量分析的材料准备
• 2.7 遗传转化载体的构建和转化
• 2.7.1 超量表达载体的构建
• 2.7.2 RNAi抑制表达载体的构建
• 2.7.3 GFP融合表达载体的构建
• 2.7.4 遗传转化
• 2.8 目标蛋白的亚细胞定位分析
• 2.8.1 通过遗传转化分析目标蛋白的亚细胞定位
• 2.8.2 通过瞬时表达分析目标蛋白的亚细胞定位
• 2.9 酵母细胞中的生化实验
• 2.9.1 转录因子在酵母中的反式激活实验
• 2.9.2 酵母单杂交实验
• 2.10 GFP的表达观察
• 2.11 GUS组织化学分析和GUS活性测定
• 2.12 成株期转基因植株在大田和PVC管的抗旱实验
• 2.13 SNAC1超量表达转基因植株叶片电镜观察
• 2.14 SNAC1超量表达转基因植株在干旱胁迫下的相对含水量
• 2.15 SNAC1超量表达转基因植株光合速率和蒸腾速率的测量
• 2.16 转基因植株的ABA敏感性实验
• 2.17 转基因植株苗期抗逆性实验
• 2.17.1 转基因植株苗期抗旱性分析
• 2.17.2 转基因植株苗期耐盐性分析
• 2.17.2.1 SNAC1转基因家系的耐盐性实验分析
• 2.17.2.2 SNAC2转基因家系的耐盐性实验分析
• 2.18 转基因植株苗期耐冷性实验
• 2.19 转基因植株的基因表达谱分析
• 3 结果与分析
• 3.1 目标基因的分离和遗传转化载体的构建
• 3.2 遗传转化和转基因植株的阳性检测
• 3.3 转基因植株的拷贝数和表达量检测
• 1代转基因植株抗旱筛选'>3.4 田间T₁代转基因植株抗旱筛选
• 1代转基因植株苗期抗旱筛选'>3.4.1 T₁代转基因植株苗期抗旱筛选
• 1代转基因植株成株期抗旱筛选'>3.4.2 T₁代转基因植株成株期抗旱筛选
• 3.5 SNAC1基因的功能研究及抗逆性分析
• 3.5.1 SNAC1基因的扩增和序列分析
• 3.5.2 SNAC1的表达模式分析
• 3.5.2.1 SNAC1在非生物逆境的表达量分析
• 3.5.2.2 SNAC1在不同组织的表达模式
• 3.5.3 SNAC1亚细胞定位分析
• 3.5.4 SNAC1在酵母细胞的生化功能
• 3.5.4.1 SNAC1具有反式激活功能
• 3.5.4.2 SNAC1能结合类似NACRS的序列
• 3.5.5 SNAC1超量表达载体的遗传转化和表达量及拷贝数的检测
• 3.5.6 SNAC1超量表达转基因植株成株期抗逆性分析
• 3.5.6.1 SNAC1转基因植株正常条件下的农艺性状测量
• 3.5.6.2 SNAC1转基因植株成株期的抗旱性鉴定
• 3.5.6.3 SNAC1转基因植株的抗旱性共分离检测
• 3.5.6.4 SNAC1转基因植株干旱胁迫下相对含水量的动态变化
• 3.5.6.5 SNAC1转基因植株的气孔开闭观察
• 3.5.6.6 SNAC1转基因植株正常条件下的光合速率和蒸腾速率
• 3.5.7 苗期SNAC1转基因植株抗逆性分析
• 3.5.7.1 苗期SNAC1转基因植株抗旱性分析
• 3.5.7.2 土培条件下SNAC1转基因植株苗期的耐盐性分析
• 3.5.7.3 水培条件下SNAC1转基因植株苗期的耐盐性分析
• 3.5.7.4 SNAC1转基因家系愈伤的耐盐性分析
• 3.5.8 SNAC1超量表达转基因植株的ABA敏感性分析
• 3.5.9 SNAC1抑制表达转基因植株的抗旱性分析
• 3.5.10 SNAC1超量表达转基因植株的基因表达谱分析
• 3.5.11 SNAC1转基因水稻和NACs转基因拟南芥的表达谱比较
• 3.6 SNAC2基因的功能研究与抗逆性分析
• 3.6.1 SNAC2基因的序列分析
• 3.6.2 SNAC2的表达模式分析
• 3.6.2.1 SNAC2在非生物逆境的表达量分析
• 3.6.2.2 SNAC2在苗期水稻不同组织的表达模式
• 3.6.2.3 SNAC2的启动子活性分析
• 3.6.3 SNAC2亚细胞定位分析
• 3.6.4 SNAC2蛋白在酵母细胞的生化功能
• 3.6.4.1 SNAC2具有反式激活功能
• 3.6.4.2 SNAC2能识别类似的NACRS的序列
• 3.6.5 SNAC2超量表达和诱导表达载体的遗传转化和表达量分析
• 3.6.6 SNAC2转基因植株苗期抗逆性分析
• 3.6.6.1 SNAC2转基因植株苗期抗旱性分析
• 3.6.6.2 SNAC2转基因家系高盐环境中的发芽率
• 3.6.6.3 SNAC2转基因植株苗期耐盐性分析
• 3.6.6.4 SNAC2转基因植株苗期耐冷性分析
• 3.6.7 SNAC2转基因植株的ABA敏感性分析
• 3.7 T052基因的功能分析
• 3.7.1 T052基因的扩增和序列分析
• 3.7.2 T052的表达模式分析
• 3.7.2.1 T052在非生物逆境的表达量分析
• 3.7.2.2 T052在不同组织的表达模式
• 3.7.3 T052启动子序列在籼粳稻之间存在差异
• 3.7.4 MYB蛋白T052定位在细胞核
• 3.7.5 MYB蛋白具有反式激活功能
• 3.7.6 SNAC1能识别MYB基因T052启动子区
• 3.8 水稻抗逆基因应用性遗传转化载体的构建
• 3.8.1 pSMDP01遗传转化载体的构建
• 3.8.2 pSMDP02遗传转化载体的构建
• 3.8.3 转化载体筛选条件的摸索
• 4 讨论
• 4.1 SNAC1基因功能的探讨
• 4.1.1 SNAC1具有转录因子的特性
• 4.1.2 SNAC1在抗旱遗传改良中的有效性
• 4.1.3 SNAC1提高植株抗旱性的几种抗旱途径
• 4.1.4 SNAC1介导的耐盐性增强可能是一种新的耐盐机制
• 4.1.5 在水稻和拟南芥中不同的NAC介导不同的抗逆途径
• 4.2 SNAC2基因功能的探讨
• 4.3 T052基因功能的探讨
• 4.4 遗传转化载体pSMDP01和pSMDP02的应用前景
• 4.5 关于后续工作的设想
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A
• 附录 B