论文摘要
焦炉工肺癌是我国八种职业肿瘤之一,也是我国职业肿瘤防治领域面临的一个重点问题。焦炉逸散物（Coke-oven emission,COE）中的致癌性多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）是导致焦炉工肺癌的主要原因。焦化生产已被国际癌症研究署（International Agency for Research on Cancer,IARC）归为“1类致癌物”。基因组不稳定性（genomic instability）是肿瘤发生过程中的重要生物学事件,微核（micronucleus,MN）是基因组不稳定性的重要形态学特征,由于其来源不明和自发率高的特点使其在一些研究不能完全反映化学物致基因组损伤的状态。近年来,随着机理的深入研究胞质分裂阻滞法微核试验（Cytokinesis-blockmicronucleus,CBMN）已经发展成为研究基因组不稳定性和细胞毒性的综合手段,即胞质分裂阻滞法微核细胞组学试验（Cytokinesis-block micronucleus cytomeassays）。“细胞组学（cytome）”的概念意味着涂片系统内计数的每一个细胞都有其细胞学意义,包括:1)存活状态—坏死、凋亡;2)有丝分裂情况—单核、中期分裂相、后期分裂相、双核、多核;3)染色体不稳定和损伤特征—微核、核质桥（Nucleoplasmic bridge,NPB）、核芽（Nuclear bud,NBUD）和核内或微核内利用着丝粒探针信号反映的信息。其中的核质桥和核芽是新的评价染色体损伤的指标,分别代表染色体断裂/重组的标志和基因扩增的标志。利用新的效应性生物标志物评价PAHs职业暴露人群的基因组不稳定性状态,综合分析基因组不稳定性的指标,有助于理解PAHs致癌的生物学过程,提高危险度评价的精度。本研究采用横断面分子流行病学设计,收集158名PAHs暴露工人和69名非多环芳烃暴露者的职业史、年龄、性别、吸烟和饮酒等信息。利用CBMN试验涂片计数核质桥和核芽的发生率,评价PAHs暴露者的基因组不稳定性状态。核质桥和核芽数经平方根转换后呈正态分布。使用方差分析比较不同外暴露等级、焦化作业工龄和年龄工人核质桥率和核芽率的差异,两两比较时采用Bonferroni校正。使用Student’s t检验比较吸烟者和不吸烟者、不同性别和不同饮酒状况工人中核质桥和核芽数的差异。利用PHASE 2.1软件经Bayesian统计方法计算个体MTHFR基因的单体型;在校正可能影响外周血淋巴细胞核质桥和核芽发生的因素（年龄、性别等）后,使用多元协方差分析比较不同基因型或单体型之间外周血淋巴细胞核质桥率和核芽率的差异。利用具有代谢苯并[a]芘（B[a]P）能力的细胞,经B[a]P染毒后,利用γ-H2AX焦点检测DNA双链断裂情况,结合CBMN细胞组学试验验证人群的研究结果,为其发展成为效应标志物提供有力证据。一、多环芳烃暴露与基因组不稳定性表型的关系研究应用外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞法微核试验制备涂片,计数核质桥和核芽发生率评价外周血淋巴细胞的染色体损伤水平。PAHs暴露工人外周血淋巴细胞核质桥率（9.41±3.73）高于非暴露组（1.88±1.49）,差异有统计学意义（P＜0.001）;其核芽率为（7.13±4.01）也明显高于非暴露组（2.20±1.73）（P＜0.001）。发现核质桥和核芽率与多环芳烃暴露等级具有明显的剂量-效应关系。尿1-OHPyr水平与外周血淋巴细胞核质桥率有良好的相关性（n=227,Pearson’s r=0.741;P＜0.001）。进一步分析,在PAHs暴露工人和非暴露组中分别研究尿1-OHPyr水平与核质桥率的关系,也都发现了明显的相关性（分别是n=158,Pearson’s r=0.245,P=0.003和n=69,Pearson’s r=0.279,P=0.02）。同样,也发现尿1-OHPyr水平与外周血淋巴细胞核芽率有良好的相关（n=227,Pearson’s r=0.639;P＜0.001）。在PAHs暴露工人和非暴露组中分别研究尿1-OHPyr水平与核芽率的关系,也都发现了明显的相关性（分别是n=158,Pearson’s r=0.294,P＜0.001和n=69,Pearson’s r=0.382,P=0.001）。主成分分析表明:核质桥和核芽与PAHs内外暴露水平均有较好的剂量—效应关系,这在微核分析中却没有发现。与男性PAHs暴露工人相比,女性PAHs暴露工人具有较少的核质桥（7.14±3.04比9.63±3.73,P=0.01）和核芽（4.71±2.73比7.36±4.05,P=0.02）发生率。校正年龄后,较长焦化作业工龄的暴露者的核芽发生率较高（P=0.01）。未发现年龄、吸烟和饮酒等对PAHs暴露工人的核质桥和核芽率的影响。二、PAHs暴露工人基因组不稳定性表型与相关基因的关联研究使用多元协方差分析校正了年龄、性别、尿中1-羟基芘后,在PAHs暴露组和非暴露组中分别比较MTHFR 677和1298两个位点与基因组不稳定性之间的关联。结果发现PAHs暴露工人中MTHFR 677位点TT基因型或CT+TT基因型个体的核质桥率显著高于CC基因型个体（P=0.03）。在非暴露组中也发现TT基因型个体的核质桥率显著高于CC基因型个体（P=0.002）,但未发现CT+TT基因型有类似的关联。以核芽为表型的研究中,没有发现这两个位点的基因多态性与核芽率的显著性关联。经单体型分析,PAHs暴露工人中携带MTHFR 677C-1298C、677T-1298A、677T-1298C单体型个体的核质桥率均高于677C-1298A单体型个体,差异有统计学意义（P=0.03,P=0.005和P=0.002）;677T-1298A单体型个体的核芽率显著高于677C-1298A单体型个体（P=0.02）。未发现非暴露组中不同MTHFR单体型与核质桥和核芽率的显著性关联。DNA双链断裂修复是维持基因组稳定性的重要机制。同源重组修复基因与基因组不稳定性的关联研究中发现,PAHs暴露工人中NBSl rs1805794、rs1805800位点,MREll rs13447623位点,RAD52 rs1051672,RAD54B rs3019148位点与核质桥的发生率相关。发现MREll rs1014666、rs11020799、rs13447623、rs622961位点和RAD54L rs10789488位点与核芽的发生率相关。非同源末端连接的修复基因的关联研究中发现XRCC4 rs1382373、rs1478485、rs4703951位点和XRCC5rs10182201、rs3821107、rs828699位点与核质桥的发生率相关;LIG4 rs1805388和XRCC4 rs4703951位点与核芽的发生率相关。提示这些位点的基因多态性可影响个体的基因组稳定性,是PAHs暴露工人染色体损伤的遗传易感因素之一。三、苯并[a]芘对基因组稳定性的影响利用转入CYP1A1的人支气管上皮细胞16HBE-CYP1A1和空载质粒细胞16HBEV,研究了苯并[a]芘对基因组稳定性的影响。结果发现,B[a]P作用后,高浓度染毒组均有γ-H2AX焦点形成,并具有剂量依赖性。利用CBMN细胞组学试验检测了B[a]P的细胞毒性,发现B[a]P染毒后,16HBE-CYP1A1细胞的双核细胞率和核分裂指数（NDI）发生降低,随着染毒剂量的增加,细胞坏死率不断升高,具有剂量—效应关系。而凋亡细胞随着B[a]P作用剂量的增加出现先增高后降低的趋势。在16HBEV细胞中,中低剂量组间（1—10μM组）的双核细胞率并没有发生明显的变化,在20μM组降至40%左右。活细胞的NDI值在高于10μM处理组的细胞中发生降低。细胞坏死率随染毒剂量增加而升高,但到高于10μM组后没有明显升高。而凋亡细胞随着B[a]P作用剂量的增加而增高,在20μM组又降为正常水平。基因组不稳定性分析中发现,在16HBE-CYP1A1细胞中,随B[a]P作用浓度的增加,核质桥和核芽发生率也随之增加,具有明显的剂量-效应关系。微核率在高于10μM组后不再发生增加。在16HBEV细胞中,B[a]P作用后,微核、核质桥和核芽的发生率都有增加趋势。但在高于5μM组后没有明显改变（P＞0.05）。研究发现,与微核相比,核质桥和核芽具有更好的剂量—效应关系。这些指标的增加可能与DNA双链断裂损伤和细胞凋亡受抑制有关。综上所述,本研究系统的分析了PAHs对基因组不稳定性的影响。在人群中发现核质桥和核芽可以作为基因组不稳定性的效应标志物。叶酸代谢酶和DNA双链断裂修复酶的遗传变异能够影响PAHs暴露工人的基因组不稳定性状态。体外研究发现,CYP1A1是B[a]P代谢的关键酶,胞质分裂阻滞法微核细胞组学试验可以综合评价B[a]P的细胞毒性和遗传毒性,证实了B[a]P致核质桥和核芽形成的剂量-效应关系,发现其遗传毒性可能与DNA双链断裂损伤和抑制凋亡有关。这些结果提示基因组不稳定性在PAHs致癌过程中扮演重要角色,综合分析其指标的改变有助于暴露人群的生物监测。