稻瘟病菌中假定Rho-GEF蛋白MoRgf1的功能研究

论文摘要

作为小G蛋白Ras超家族成员之一的Rho GTP酶,调控多种细胞活动过程,例如细胞形态建成、基因表达、囊泡运输等。大部分Rho GTP酶作为分子开关,在细胞中有两种状态：GDP结合的失活态和GTP结合的活性态。鸟苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor, GEF）的功能是促进Rho GTP酶从GDP结合态向GTP结合态的转换。本研究首先通过生物信息学的方法对稻瘟病菌的MoRgf1 （MGG03064）的理论等电点、分子量、结构域以及功能等进行预测分析,结果显示该基因是小G蛋白Rho1的GEF。然后通过同源重组的方法得到该基因的敲除突变体,发现该基因的缺失突变体虽然生长速度缓慢,然而隔膜间距与野生型相比无明显差异,说明该基因可能参与了细胞分裂周期的调控。突变体在加有SDS的淀粉酵母培养基中的生长速度受到抑制,说明细胞壁的完整性受到影响。另外,突变体不能产生分生孢子,且菌丝块接种造伤的水稻和大麦叶片均不致病。将带有启动子的MoRGF1基因转入敲除突变体中,表型得以恢复,说明敲除突变体的表型缺陷是由于MoRGF1的缺失直接或间接导致。利用酵母双杂交的方法验证了该蛋白中的RhoGEF结构域与Rho族蛋白的互作情况,发现RhoGEF结构域没有很强的特异性,可与多个Rho族蛋白的持续激活态（CA）互作,是否与Rho1直接互作需要进一步验证。由于MoRGF1敲除突变体导致稻瘟病丧失致病能力,因而有可能通过该基因的研究找到合适药物靶标,为稻瘟病的防治提供新的策略。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 引言
• 1 小GTP结合蛋白
• 1.1 小G蛋白的结构
• 1.2 小G蛋白的分类
• 1.3 小G蛋白的定位
• 1.4 小G蛋白的调控机理
• 1.4.1 鸟苷酸转换因子（Guanine nucleotide exchange factors-GEFs）
• 1.4.2 GTP酶激活蛋白（GTPase activating proteins-GAPs）
• 1.4.3 鸟苷酸解离抑制因子（Guanine nucleotide dissociation inhibitors-GDIs）
• 2 Rho族蛋白及RhoGEF蛋白
• 2.1 Rho族蛋白结构
• 2.2 Rho族蛋白的生物学功能
• 2.3 真菌中的Rho蛋白及RhoGEF蛋白的研究
• 3 稻瘟病及稻瘟病菌
• 3.1 稻瘟病
• 3.2 稻瘟病菌及其侵染致病过程
• 4 稻瘟病菌Rho族蛋白及其GEF蛋白的研究意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 细菌菌株以及稻瘟病菌菌株
• 1.2 各类培养基
• 1.2.1 E.coli DH5α细菌培养基
• 1.2.2 表达培养基（固体）
• 1.2.3 表达培养基（液体）
• 1.2.4 CM培养基
• 1.2.5 淀粉酵母培养基（SYM）
• 1.2.6 米糠培养基
• 1.2.7 TB3培养基
• 1.2.8 SD培养基
• 1.2.9 YPDA培养基（100mL）
• 1.3 生化试剂
• 1.4 抗生素
• 1.5 植物材料
• 2 实验方法
• 2.1 生物信息学分析
• 2.1.1 Morgf1与其它真菌Rho-GEF系统进化关系的分析
• 2.1.2 蛋白结构域的分析
• 2.2 常规PCR
• 2.3 PCR产物的克隆
• 2.4 质粒酶切与连接
• 2.5 DNA的琼脂糖电泳
• 2.6 DNA片段的凝胶回收
• 2.7 质粒DNA的提取
• 2.8 E.coil DH5α感受态细胞的制备
• 2.9 大肠杆菌转化
• 2.10 稻瘟病菌原生质体制备和转化
• 2.11 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 2.12 Southern杂交
• 2.12.1 DNA转印
• 2.12.2 探针的扩增
• 2.12.3 探针的标记
• 2.12.4 探针标记效价的检测
• 2.12.5 杂交及洗膜
• 2.12.6 免疫显色
• 2.13 酵母双杂交
• 2.13.1 AH109感受态细胞的制备
• 2.13.2 重组质粒的转化
• 2.14 互补载体的构建
• 2.15 稻瘟病菌生长速率的测定
• 2.16 菌丝隔膜染色及观察
• 2.17 分生孢子梗的观察
• 2.18 水稻及大麦致病性鉴定
• 第三部分 结果及分析
• 1 生物信息学分析
• 03064）蛋白结构及功能的预测'>1.1 稻瘟病菌中MoRgf1（MGG₀3064）蛋白结构及功能的预测
• 03064）在真菌中同源蛋白序列的比对、同源蛋白结构域的比对以及系统演化分析'>1.2 MoRgf1（MGG₀3064）在真菌中同源蛋白序列的比对、同源蛋白结构域的比对以及系统演化分析
• 1.3 分子量及等电点的预测分析
• 03064）的功能分析'>2 稻瘟病菌中MoRGF1（MGG₀3064）的功能分析
• 2.1 MoRGF1敲除突变体的获得及PCR验证
• 2.2 Southern杂交验证敲除突变体
• 2.3 功能互补突变体的获得及鉴定
• 2.4 突变体表型分析
• 3 酵母双杂交
• 第四部分 小结与讨论
• 1 稻瘟病菌中MoRgf1蛋白的生物信息学分析
• 2 稻瘟病菌中MoRGF1突变体表型分析中Rho1功能的体现
• 3 进一步研究的展望
• 参考文献
• 附表
• 致谢