肿瘤发生候选基因ASB11-1和心脏发育候选基因XIRP1的表达和功能初步研究

论文摘要

肿瘤严重危害着人类的身体健康,因此研究肿瘤相关基因及其分子机制对于肿瘤的治疗至关重要。在肿瘤的研究中已发现,某些基因在时空上的表达紊乱可导致肿瘤的发生。鉴定与肿瘤发生相关的基因和分子途径,将促使人们从分子水平认识肿瘤发生的机制。本文克隆的ASB11-1基因属于ASB基因家族的新成员,其编码蛋白含有两个结构域,6个被称为ankyrin repeat的锚蛋白重复序列位于其N端,在其C端是一个被称为SOCS的细胞信号因子抑制结构域。该基因位于染色体Xp22.31上,由7个外显子构成。RT-PCR检测癌细胞系与正常组织该基因的表达差异,发现该基因表达明显上调,暗示该基因可能与癌症相关。Northern blot显示ASB11包含2.9kb和5.0kb两个转录本,并且两个转录本在心肌和骨骼肌特异性表达。亚细胞定位显示ASB11-1基因在细胞质和细胞核表达。通过对p53、p21信号途径分析以及mRNA、蛋白表达水平的检测,发现该基因明显上调p53、p21的表达水平。已有的文献报道XIRP1基因是人类心脏和骨骼肌特异表达的基因,其鸡的同源基因参与BMP-Nkx2.5-MEF2C途径而调节心肌的形成,其同源基因在Nkx2.5、MEF2C敲除小鼠中表达量明显下调,说明XIRP1基因是Nkx2.5、MEF2C的靶基因,为了进一步的弄清其调节机制,本人克隆了XIRP1基因上游2100bp的区域,通过将2.1kb的区域分段成1.9kb、1.2kb、1.0kb、0.8kb、0.6kb、0.3kb、0.2kb分别克隆到pGL3-basic载体,进行荧光素酶活性检测确定了在转录起始位点上游-127——77的50bp区域活性最强为启动子核心区域,将核心区域上的Nkx2.5、MEF2C、Hand2位点突变后,发现其活性明显下降,从而证实了Nkx2.5、MEF2C、Hand2位点的真实性,并说明Nxk2.5、MEF2C、Hand2可能是通过调节启动子区域来调节XIRP1基因的表达,并且首次发现XIRP1基因也是Hand2的靶基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 癌症发生的相关基因
• 1.1.1 原癌基因
• 1.1.2 抑癌基因
• 1.1.3 转录因子
• 1.1.4 其它生长因子和受体
• 1.2 细胞周期调控与肿瘤关系简述
• 1.2.1 CDK1.复合体对细胞周期调控机制
• 1.2.2 Cyclins复合体对细胞周期调控机制
• 1.2.3 CKI对细胞周期调控机制
• 1.2.4 p53对细胞周期的调节
• 1.3 泛素蛋白酶体途径与癌症关系
• 1.3.1 泛素-蛋白酶体系统组成及功能
• 1.3.2 泛素-蛋白酶体途径与p53
• 1.3.3 泛素-蛋白酶体途径与p27、cyclin
• 1.3.4 泛素-蛋白酶体途径与HIF、NF-KB
• 1.3.5 泛素-蛋白酶体途径与恶性肿瘤的其他相关研究
• 1.4 ASB基因家族与泛素-蛋白酶体途径
• 1.5 本课题研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 生物信息学软件
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 细胞、菌株和质粒
• 2.1.4 主要实验仪器和耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA的抽提
• 2.2.2 PCR反应
• 2.2.3 Northern blot
• 2.2.4 细胞培养
• 2.2.5 细胞瞬时转染和稳定转染的筛选
• 2.2.6 荧光素酶分析
• 2.2.7 Western blot
• 2.2.8 本文所用质粒构建流程图
• 第三章 实验结果及其分析
• 3.1 人类ASB11基因计算机克隆及生物信息学分析
• 3.1.1 ASB11基因计算机克隆
• 3.1.2 ASB11蛋白质产物
• 3.1.3 ASB11与同源基因的编码蛋白的同源性比较及进化分析
• 3.1.4 人ASB基因家族保守性比较
• 3.2 ASB11-1基因ORF克隆
• 3.3 ASB11-1亚细胞定位分析
• 3.4 ASB11 Nortem blot分析
• 3.5 ASB11-1在成人组织与细胞系中的表达差异
• 3.6 ASB11-1对p53、p21的影响
• 3.6.1 ASB11-1信号途径分析
• 3.6.2 ASB11-1对p53、p21mRNA水平的影响
• 3.6.3 ASB11-1对p53、p21蛋白水平的影响
• 3.6.4 ASB11-1对MDM2的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 ASB11-1与泛素-蛋白酶体降解途径的关系
• 4.2 ASB11-1与肿瘤的关系
• 结语
• 参考文献
• 第五章 其他工作
• 5.1 前言
• 5.1.1 心脏发育简介
• 5.1.2 启动子简介
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果及其分析
• 5.3.1 启动子的克隆和生物信息学分析
• 5.3.2 启动子活性研究
• 5.4 小结
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢