盐酸克伦特罗、莱克多巴胺兽药残留免疫层析检测方法的研究

论文摘要

目的：研制盐酸克伦特罗（CL）、莱克多巴胺（RAC）胶体金免疫层析联卡快速检测试纸条,用于猪尿中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺残留的检测。并初步建立RAC胶乳荧光免疫层析快速检测方法,以提高检测灵敏度。方法：采用饱和硫酸铵沉淀法纯化RAC腹水,并用BCA试剂盒测定其抗体蛋白浓度。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；用胶体金标记上适当浓度的CL、RAC抗体。将标记好的复合物喷涂于结合垫上,羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素（NC）膜表面,作为质控线（C线）,采用重氮法和活性酯法合成检测抗原CL-BSA和RAC-BSA包被在NC膜表面,作为检测线（T1和T2线）。检测过程中CL-BSA、RAC-BSA与待测样品中CL、RAC竞争结合有限的胶体金标记抗CL、RAC单抗,样品中的CL、RAC越多则其结合的标记抗体越多,则结合到T线的标记抗体越少,T线的显示越弱甚至消失,因此根据颜色直观显示检测的半定量结果。用同样方法,把标记物由胶体金换成胶乳荧光颗粒,利用其在紫外灯激发下发出荧光以判断结果,初步建立RAC胶乳荧光免疫层析快速检测方法。结果：成功合成检测抗原CL-BSA和RAC-BSA。成功制备了30 nm颗粒大小均一的胶体金。建立了联卡检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺的胶体金免疫层析法,5分钟内即可用肉眼观察到结果；检测猪尿时,最低检测限CL和RAC的灵敏度都为5ng/mL;特异性高,CL, RAC, SAL等类似物之间没有交叉反应；稳定性好,室温下保存7周不失效。成功将RAC抗体标记上胶乳荧光颗粒,并初步建立RAC胶乳荧光免疫层析快速检测方法,于紫外灯下以对比法判读结果,灵敏度可达到0.5 ng/mL。结论：本研究建立的盐酸克伦特罗（CL）、莱克多巴胺（RAC）胶体金免疫层析联卡快速检测试纸条操作便捷,稳定可靠,灵敏度高,可作为猪尿中盐酸克伦特罗（CL）、莱克多巴胺（RAC）残留现场检测和监控的有效手段。初步建立了灵敏度更高的RAC胶乳荧光免疫层析快速检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写符号说明
• 第一部分 绪论
• 1 CL,RAC的理化、药理性质
• 2 CL,RAC的毒性
• 3 CL,RAC的残留现状
• 4 当前检测CL,RAC的主要检测方法
• 4.1 气相色谱-质谱联用法（GC/MS）
• 4.2 生物传感器技术（BS）
• 4.3 酶联免疫法（ELISA）
• 4.4 胶体金免疫层析法
• 5 研究的目的和意义
• 6 胶体金免疫层析技术
• 7 胶乳荧光免疫层析试纸条
• 8 实验路线
• 第二部分 材料与方法
• 1 试剂材料与仪器
• 1.1 主要试剂及材料
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 主要溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 完全抗原CL-BSA和RAC-BSA的合成
• 2.1.1 盐酸克伦特罗完全抗原CL-BSA的合成
• 2.1.2 莱克多巴胺完全抗原RAC-BSA的合成
• 2.2 抗RAC单克隆抗体的制备与鉴定
• 2.2.1 细胞克隆化
• 2.2.2 杂交瘤细胞培养上清的检测
• 2.2.3 阳性杂交瘤细胞的扩增与冻存
• 2.2.4 F1杂交瘤细胞的接种
• 2.2.5 腹水的采集
• 2.2.6 腹水的效价测定
• 2.2.7 腹水的纯化
• 2.2.8 纯化后单抗的浓度测定
• 2.3 胶体金的制备
• 2.4 胶体金-抗CL单抗复合物（Anti-CL-Au）和胶体金-抗RAC单抗复合物（Anti-RAC-Au）的制备
• 2.4.1 胶体金与抗体偶联最佳pH的测定
• 2.4.2 最小抗体浓度的测定
• 2.4.3 胶体金与抗体的偶联
• 2.5 胶体金免疫层析试纸条的制备
• 2.5.1 样品垫的预处理
• 2.5.2 金标垫的制备
• 2.5.3 NC膜划线
• 2.5.4 试纸条的组装
• 2.6 试纸条灵敏度、特异性和稳定性的测定
• 2.6.1 灵敏度的测定
• 2.6.2 特异性的测定
• 2.6.3 稳定性的测定
• 2.7 CL,RAC胶体金检测联卡的制备
• 2.7.1 胶体金的制备
• 2.7.2 CL,RAC抗体与胶体金偶联
• 2.7.3 金标垫的制备
• 2.7.4 NC膜划线
• 2.7.5 试纸条的组装
• 2.8 利用CL,RAC胶体金联卡检测猪尿
• 2.9 胶乳荧光标记免疫层析检测技术的初步建立
• 2.9.1 胶乳荧光颗粒-抗CL复合物的制备
• 2.9.2 胶乳荧光试纸条的组装
• 2.9.3 胶乳荧光颗粒免疫层析检测试纸条的使用及判断方法
• 第三部分 结果与讨论
• 1 完全抗原CL-BSA和RAC-BSA的鉴定
• 1.1 完全抗原CL-BSA的鉴定
• 1.2 完全抗原RAC-BSA的鉴定
• 2 标记用单抗的鉴定
• 2.1 克隆化细胞培养上清的检测
• 2.2 腹水型单抗效价的测定
• 2.3 纯化后单抗浓度的测定
• 3 胶体金的表征
• 3.1 胶体金的可见光光谱扫描
• 3.2 胶体金的透射电镜鉴定
• 4 Anti-RAC-Au和Anti-CL-Au的鉴定
• 4.1 胶体金与抗体偶联最佳pH的确定
• 4.2 标记用最小抗体浓度的确定
• 5 试纸条的调试
• 5.1 金标垫喷金量的确定
• 5.2 C/T线包被浓度的确定
• 6 试纸条灵敏度、特异性和稳定性的测定
• 6.1 灵敏度的测定
• 6.2 特异性的测定
• 6.3 稳定性的测定
• 7 CL,RAC胶体金联卡检测猪尿样品
• 8 RAC胶乳荧光颗粒标记免疫层析快速检测方法的初步建立
• 8.1 C,T线包被浓度的确定
• 8.2 灵敏度的测定
• 第四部分 小结
• 参考文献
• 在读期间发表论文和学术交流情况
• 致谢