神经干细胞低温保存的传质渗透特性研究

论文摘要

超低温冷冻保存神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）对神经系统退行性疾病和组织损伤等疾病的临床治疗具有十分重要的意义。本文对神经干细胞的体外培养进行研究,通过细胞形态学观察、台盼蓝染色法、Hochest/PI荧光双重染色法及生长曲线的测定。证明了所培养的细胞具有增殖能力等神经干细胞的主要特性,保证了实验材料的生物活性,为后续实验提供充足的细胞来源。通过渗透压技术对冷冻保护剂（cryoprotective agent, CPA）的浓度进行实验测定。本文选取了两种冷冻保护剂,考察了冷冻保护剂种类、浓度、细胞密度等因素对神经干细胞的影响。实验结果表明,渗透压法是一种既简洁又准确的表征溶液中主要溶质浓度的方法；冷冻保护剂在导入过程中造成的细胞损伤主要为渗透损伤和毒性损伤,受二者共同作用存在冷冻保护剂最佳导入时间和最优导入方案。采用显微图像采集分析的方法,以氯化钠为神经干细胞的非渗透性溶质,成功获得悬浮神经干细胞渗透不变体积比为0.391。最后,分别应用K-K模型和经典两参数模型来表征CPA和水在神经干细胞中一维输运的物理过程。确定保护剂二甲基亚砜（DMSO）和乙二醇（EG）导入神经干细胞时的三个渗透参数Lp（水的胞膜渗透率）、ω（保护剂的胞膜渗透率）、σ（反射系数）值。结果分别为：K-K模型DMSO：Lp=0.172μm/minatm, co=8.980×10-2μm/s,σ=0.92; EG:Lp=0.198μm/min atm, co=7.880×10-2μm/s, a=0.90;2-P模型DMSO:Lp=0.168μm/min atm,ω=9.081×10-2μm/s; EG:Lp=0.174μm/min atm,ω=8.009×10-2μm/s。为进一步优化冷冻保护剂在神经干细胞中的导入和洗脱方案提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 神经干细胞的定义
• 1.2 神经干细胞的生物学特征
• 1.3 神经干细胞的应用
• 1.4 低温保存
• 1.4.1 低温保存技术发展史
• 1.4.2 低温损伤原理
• 1.4.3 低温冷冻保存方法
• 1.4.4 低温冷冻保护剂
• 1.5 玻璃化技术
• 1.5.1 实现玻璃化的途径
• 1.5.2 玻璃化法的步骤
• 1.6 神经干细胞的低温保存
• 1.7 本文工作思路及主要内容
• 2 神经干细胞的培养
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验药品与装置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 神经干细胞的传代培养
• 2.2.3 细胞计数
• 2.2.4 神经干细胞生长曲线的测定
• 2.2.5 神经干细胞的死活鉴定
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 神经干细胞的传代培养
• 2.3.2 神经干细胞生长曲线的测定
• 2.3.3 神经干细胞完整性及活性鉴定
• 2.4 小结
• 3 实验测定保护剂导入过程的渗透特性
• 3.1 概述
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验药品和装置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 渗透压法
• 3.3.2 实验过程及步骤
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 DMSO浓度对导入过程的影响
• 3.4.2 乙二醇浓度对导入过程的影响
• 3.4.3 两种保护剂的对比
• 3.5 小结
• 4 神经干细胞渗透不变体积的测定
• 4.1 概述
• 4.2 Boyle-Van't Hoff关系式
• 4.3 细胞渗透不变体积的实验测定
• 4.3.1 实验仪器设备
• 4.3.2 实验材料
• 4.3.3 实验操作过程
• 4.3.4 实验结果与讨论
• 4.4 小结
• 5 模型参数的回归
• 5.1 概述
• 5.2 K-K模型与两参数模型
• 5.3 渗透参数的实验测定
• 5.3.1 实验仪器装置
• 5.3.2 实验材料
• 5.3.3 实验操作步骤
• 5.3.4 实验结果与讨论
• 5.4 模型参数的回归
• 5.4.1 细胞体积变化的计算
• 5.4.2 参数回归
• 参考文献
• 附录A K-K模型计算程序
• 附录B 2-P模型计算程序
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢