胡萝卜高效遗传转化体系的建立及遗传稳定性的研究

论文摘要

轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体,尤其在发展中国家,每年受轮状病毒危害的婴幼儿数量非常巨大。目前,对轮状病毒感染最有效的预防和控制措施,仍是注射疫苗。VP4 和VP7 是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原,VP6 是主要的病毒蛋白,能诱导产生IgG 抗体和IgA 抗体,与保护性免疫有关。这三个基因片段是发展基因工程疫苗的首选。　本试验以胡萝卜下胚轴为受体材料,通过农杆菌介导法将轮状病毒片段基因VP4、VP6 和VP7 转入胡萝卜中,对胡萝卜转化体系中的一些关键性的步骤进行了条件优化,如:下胚轴的浸染时间、共培养时间、Kan 敏感试验、Cab 和Cef 的对比试验等对转化的影响,建立了高效的胡萝卜遗传转化体系。主要研究结果如下:　1.用农杆菌浸染7～9　d 苗龄的胡萝卜下胚轴约15　min,共培养2～3　d 后,转入B5附加75　mg/L　Kan+500　mg/L　Cab 的愈伤诱导培养基上,待形成抗性愈伤后,继代到B5附加100　mg/L　Kan　+　500　mg/L　Cab 的抗性芽诱导培养基上,当苗长至2～3　cm 时,转入B5附加　0.1　mg/L　IBA　+　75　mg/L　Kan　+　300　mg/L　Cef 的生根培养基上,2～3 周后可得到Kan 抗性苗。　2.　经过几次Kan 的筛选,得到Kan 抗性植株408 棵,并对其进行PCR 检测。其中156 棵转VP6 基因的Kan 抗性植株,有58 棵为PCR 阳性,阳性率达到37.2　% ;172棵转VP7 基因的Kan 抗性植株,有84 棵为PCR 阳性,阳性率达到48.8　%;80 棵转VP4 基因的Kan 抗性植株,有31 棵为PCR 阳性,阳性率达到38.8　%。　3. 用塑料布覆盖并逐渐打开通风口方法炼苗,抗性植株长势好,抗性强,成活率提高了35　%。低温春化,试验大棚和陆地相比,死亡率降低了49.5　%。　4.　对T0代转VP6 和VP7 基因的植株经RT-PCR 检测初步证明了VP6、VP7　基因的转录。对T1代转VP6和VP7基因的植株分别进行了PCR、PCR-Southern　blot和Southern　blot 检测,证明目的基因已经整合到胡萝卜基因组上。　5. 对7 个株系T1代植株的PCR 分析,得出其中两株系接近1:1,另两株系为1:3。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物基因工程的研究进展
• 1.1.1 球转基因植物的发展现状及其应用
• 1.1.2 转基因植物的遗传转化方法
• 1.1.2.1 载体系统转化方法
• 1.1.2.2 直接遗传转化方法
• 1.1.3 植物基因工程存在的技术问题
• 1.2 转基因植物口服疫苗的研究进展
• 1.2.1 转基因植物口服疫苗的作用机理
• 1.2.2 口服疫苗抗原和受体植物的选择
• 1.2.3 利用转基因植物生产疫苗的途径
• 1.2.3.1 瞬时表达系统
• 1.2.3.2 稳定表达系统
• 1.2.4 转基因植物口服疫苗的优点
• 1.2.5 转基因植物口服疫苗研究成功事例
• 1.2.6 转基因植物疫苗在临床实验上的效果
• 1.2.7 转基因植物疫苗存在的问题和对策
• 1.3 轮状病毒（RV）研究概述
• 1.3.1 轮状病毒的基因结构及病毒蛋白
• 1.3.1.1 轮状病毒的基因组结构及编码产物
• 1.3.1.2 病毒蛋白
• 1.3.2 轮状病毒的发病机理及免疫保护机制
• 1.3.3 轮状病毒的流行病学
• 1.3.4 轮状病毒疫苗的研究进展
• 1.3.4.1 早期的轮状病毒疫苗—轮状病毒口服减毒活疫苗
• 1.3.4.2 多价重组疫苗
• 1.3.4.3 亚单位疫苗
• 1.3.4.4 DNA疫苗
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 化学试剂、生长调节剂和酶试剂
• 2.1.3.1 组织培养试剂
• 2.1.3.2 酶和试剂盒
• 2.1.3.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂、培养基的配制
• 2.1.4.1 主要溶液的配制
• 2.1.4.2 主要培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 无菌苗的获得
• 2.2.2 根癌农杆菌浸染液的准备
• 2.2.3 外植体处理
• 2.2.4 遗传转化体系的建立及优化
• 2.2.4.1 浸染时间对转化的影响
• 2.2.4.2 共培养时间对转化的影响
• 2.2.4.3 卡那霉素（Kan）敏感性实验
• 2.2.4.4 羧苄青霉素（Cab）和头孢霉素（Cef）浓度对比试验
• 2.2.4.5 叶盘法转化胡萝卜下胚轴
• 2.2.5 炼苗和移栽方法
• 2.2.5.1 无菌炼苗
• 2.2.5.2 炼苗
• 2.2.5.3 陆地和大棚低温对比试验
• 0代种子和T₁代植株的获得'>2.2.6 T₀代种子和T₁代植株的获得
• 0和T1_代转基因植株的分子生物学检测'>2.2.7 T₀和T1_代转基因植株的分子生物学检测
• 0和T₁代植株基因组DNA的提取'>2.2.7.1 T₀和T₁代植株基因组DNA的提取
• 0代转基因植株的PCR检测'>2.2.7.2 T₀代转基因植株的PCR检测
• 0代植株总RNA的提取'>2.2.7.3 T₀代植株总RNA的提取
• 0代植株的RT-PCR检测'>2.2.7.4 T₀代植株的RT-PCR检测
• 1代植株的PCR检测'>2.2.7.5 T₁代植株的PCR检测
• 1代植株的PCR-Southern blot检测'>2.2.7.6 T₁代植株的PCR-Southern blot检测
• 1代植株的Southern blot检测'>2.2.7.7 T₁代植株的Southern blot检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 胡萝卜转化体系的建立
• 3.1.1 浸染时间的影响
• 3.1.2 共培养时间对转化的影响
• 3.1.3 Kan对抗性植株的影响
• 3.1.4 Cab和Cef浓度对比试验结果
• 3.2 抗性植株的炼苗和移栽方法
• 3.3 转基因胡萝卜的分子生物学检测
• 0代转基因胡萝卜植株的PCR分析'>3.3.1 T₀代转基因胡萝卜植株的PCR分析
• 0代转基因胡萝卜植株的转基因植株的RT-PCR分析'>3.3.2 T₀代转基因胡萝卜植株的转基因植株的RT-PCR分析
• 1代胡萝卜植株的遗传分析和PCR检测'>3.3.3 T₁代胡萝卜植株的遗传分析和PCR检测
• 1代转基因胡萝卜植株的PCR-Southern分析'>3.3.4 T₁代转基因胡萝卜植株的PCR-Southern分析
• 1代转基因胡萝卜植株的Southernblot结果分析'>3.3.5 T₁代转基因胡萝卜植株的Southernblot结果分析
• 第四章 讨论
• 4.1 胡萝卜下胚轴遗传转化体系的建立
• 4.2 抗性植株炼苗
• 4.3 关于转基因植株的检测
• 1代转基因胡萝卜遗传稳定性的分析'>4.4 关于T₁代转基因胡萝卜遗传稳定性的分析
• 4.5 本研究下一步的工作
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 图版
• 个人简介
• 导师简介
• 独创性声明