论文摘要
目的作为核酸结构的一部分,核糖或脱氧核糖在自然界中总是以D-构型存在的,因而在很长的一段时间内科学家研究的核苷或核苷类药物大多是以D-构型为主,如齐多夫定、司他夫定等。而且通常酶具有立体选择性并只对手性底物的某一种对映体起作用,所以长期以来忽视了核苷类活性化合物对映体L-核苷的作用。人们以为与天然核苷类化合物类似的光学活性物质总是比人工合成的L-对映体高,然而拉米夫定的上市改变了这种观点。L-核苷是天然核苷的对映异构体,两者在手性中心上的构型相反。除旋光活性外,L-核苷的物理、化学性质均与D型对映体相同,然而其药理性质却有差别,主要原因有三点:（1）核苷转移到细胞内的过程不同;（2）作用在这些物质上的组合酶和分解酶不同;（3）与病毒靶点酶的作用不同。其中核苷与相应5’-单磷酸酯的合成代谢对核苷的活化作用最为关键,且这一过程是高度立体选择性的。假如核苷分子中杂环部分在糖基部分中处于和4’-羟甲基顺式的位置,则称为β型核苷。经研究发现,很多L-构型的核苷类药物不但具有潜在的抗病毒活性,而且通常具有较小的细胞毒性,如碘苷,实验表明L-IDU体外抗病毒活性只有D-IDU的20%,又如溴乙烯去氧尿苷,其L-构型化合物的抗病毒活性也比D-构型的要低。但这些核苷类药物L-构型类似物的细胞毒性都要远远低于D-构型。β-L-核苷类似物的研究已成为一个新的热点。由于发现了3TC优良的抗HIV、HBV生物活性,关于L-2’,3’-脱氧核苷类似物及其对映体已有不少人作了大量的合成及抗HIV、HBV方面的研究。我们研究的β-L-D4A是一种新型核苷类化合物,其化学结构不同于3TC,其碱基不是C（胞嘧啶）,而是A（腺嘌呤）,戊糖环呈不饱和双键结构。在这项研究中,我们采用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞作为细胞模型,研究β-L-D4A对2.2.15细胞HBV的抑制作用及细胞毒性研究,初步探讨β-L-D4A体外抗HBV作用。方法2.2.15细胞用胰酶消化液消化,以浓度1×105/well接种于24孔培养板,每孔110μL加DMEM培养液1.5ml,于5%CO2培养箱中37℃培养48小时后,细胞贴壁生长良好。三组分别换含不同药物浓度的培养液,阳性对照组加含3TC的培养液,空白对照每孔加1.5ml含10%胎牛血清的DMEM培养液。β-L-D4A和3TC设0.0001uM,0.001uM,0.01uM,0.1uM,1uM,10uM,100uM7个浓度点,每个药物浓度设三个平行孔。每3天换新鲜含药培养液,共2次,8天后分别收集细胞上清和细胞,保存到-20℃待检。用NP-40细胞裂解液（50 mM Tris-HCl[pH7.4],150 mM NaCl, 5mM MgCl2,0.2%NonidetP-40）室温下裂解细胞20min。裂解液以16,000r/min离心5分钟,弃去沉淀。细胞上清中加入等体积20%PEG8000和1MNaCl,充分溶解混匀,4℃放置2小时,12,000g离心30分钟。含有HBV核心颗粒的沉淀用蛋白酶K消化液（10 mM Tris[PH7.6],10 mM EDTA 0.25%SDS,1mg/ml proteinase K）重悬,56℃作用2小时,之后用酚氯仿抽提继而乙醇沉淀提取DNA。抽提得到的DNA溶解于TE中,行琼脂糖凝胶电泳。将电泳后的DNA利用毛细管转移的方法转到带正电荷的尼龙膜上。以HBV DNA全长基因组为模板,随机引物引发制备地高辛标记的探针。将探针与膜杂交,抗地高辛抗体孵育,NBP/BCIP显色。提取所得的HBVDNA亦用荧光定量PCR的方法进行检测。利用下面公式计算药物抑制率:抑制率-（阴性对照组HBV DNA量-药物处理组HBV DNA量）/阴性对照组HBV DNA量×100%。50%药物抑制浓度（IC50）根据Reed Muench方法进行计算得出。用ELISA法检测上清液中HBsAg的含量。本实验室既往研究显示:2.2.15细胞接种后第1天在培养液上清中即可检测到抗原分泌,随着培养时间延长,病毒抗原分泌量逐渐增加,到接种后第7-8天达到高峰,此后抗原分泌逐渐稳定。2.2.15细胞按1×105/孔接种于24孔培养板中,每孔含10%胎牛血清的DMEM培养液1ml,培养过夜后,弃掉旧培养液,各孔加入含药培养液,药物的浓度梯度为:0.0001uM、0.001uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM、100uM。隔日一次换含药培养液,接种后第9天收集培养液上清,吹匀后,每孔取50ul用ELISA法检测上清液中HBsAg的含量。药物细胞毒性通过MTT法测定细胞存活率。HepG2细胞以浓度1×105/ml接种于96孔培养板,24小时后换用含不同浓度β-L-D4A或3TC的培养基处理,β-L-D4A和3TC设31.25、62.5、125、250、500、1000umol/L6个浓度点,每个药物浓度设4个平行孔。3天后用MTT比色法分析检测细胞吸光度值。用下面公司计算细胞抑制率:细胞抑制率（%）=（试验组光吸收值-对照组光吸收值）/对照组光吸收值×100%。应用SPSS10.0进行统计学分析,当P<0.05认为差异有显著性。结果为了研究β-L-D4A对细胞中HBV DNA复制的影响,从药物处理后的2.2.15细胞中抽提HBV DNA,用Southern杂交的方法进行检测。结果显示β-L-D4A药物处理组HBV DNA的量比阴性对照组少,而且随着β-L-D4A浓度越高,对HBV DNA的抑制影响越明显,这与3TC药物处理组观察到的结果相似。从2.2.15细胞中提取的HBVDNA用荧光定量PCR的方法进行定量分析。根据检测结果计算抑制率,绘制抑制率曲线。结果显示β-L-D4A对HBV DNA的复制有抑制作用,与3TC作用类似。根据检测结果依Reed Muench方法计算IC50,β-L-D4A和3TC的IC50值分别是0.61uM、0.30uM。用含不同浓度药物的培养基培养2.2.15细胞,8天后用ELISA法检测上清中的HBsAg含量。β-L-D4A于低浓度时无明显抑制HBsAg的分泌的作用,当其浓度为最高浓度100uM时,对HBsAg的抑制率高于50%,而当3TC为100uM时,对HBsAg的抑制率低于40%。经T检验分析,结果有统计学意义。当药物浓度低于125μM,β-L-D4A和3TC的细胞毒性都不明显。当药物浓度在1000uM时,细胞存活率低于50%。根据Reed Muench方法计算两种药物的TD50值,β-L-D4A和3TC分别为417uM和243uM。结论2.2.15细胞是用含有2个头尾相连HBV DNA全基因的表达质粒和带有耐新霉素基因的载体共转染人肝癌细胞株HepG2而建立的,该细胞株能长期稳定地向培养上清液中分泌病毒蛋白和完整的病毒颗粒,而且还能产生大量的病毒复制中间体,是体外筛选抗HBV药物较好的细胞模型。正如已有研究所证实的,2.2.15细胞稳定分泌HBsAg、HBeAg并具备一定的规律性,本实验中也观察到的,2.2.15细胞在接种24孔板次日即可检测到HBsAg、HBeAg的分泌,随着接种时间延长,抗原分泌逐渐增加,到接种后7-8天抗原分泌达高峰,以后呈现平台现象。正是这种稳定性是短暂表达细胞系和共转染体系所无法比拟的,而且2.2.15细胞内存在整合型HBVDNA,可长期产生HBV及其抗原,排泌功能可保持12月之久,因而可以完整再现HBV的复制和表达,在进行抗HBV治疗研究中,可以进一步探讨治疗机理,通过Southern blot斑点杂交,Northern blot,ELISA,Western blot等方法可以判断药物是在复制、转录或表达的哪一个环节上产生抗病毒活性的,从而为进一步研究HBV生物学特性、致病机制以及乙型肝炎的预防、诊断及治疗等奠定基础。所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法可快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量,不必等到抗体的产生就可进行测定。因此其检测水平远远高于ELISA法。实时荧光定量PCR技术现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面研究。本课题采用实时荧光定量PCR法检测细胞内HBV DNA含量的变化,说明β-L-D4A的抗HBV活性。在这项研究中,我们发现β-L-D4A以浓度依赖性的方法抑制HBVDNA复制,与3TC作用类似。根据检测结果依Reed Muench方法计算IC50,β-L-D4A和3TC的IC50值分别是0.61uM、0.30uM。β-L-D4A对HBsAg表达的抑制效应不如对HBV DNA复制的抑制效应明显。当β-L-D4A在最高浓度100umol/L时,对HBsAg表达抑制效率略高于50%。当药物浓度低于125uM,β-L-D4A和3TC的细胞毒性都不明显。当药物浓度在1000uM时,细胞存活率低于50%。根据ReedMuench方法计算两种药物的TD50值,β-L-D4A和3TC分别为417uM和243uM。实验结果显示其为高效低毒的抗HBV药物。β-L-D4A是一中新型的L构型的核苷类似物,为dATP的结构类似物。从20世纪60年代有报道L构型的核苷类化合物以来,在其后的40多年时间中研究者发现相对于D构型的核苷类化合物,L构型的核苷类化合物不论是生物学活性还是药物的安全性都要优于前者。β-L-2’,3’-双脱氧-3’-硫胞嘧啶核苷即拉米夫定,是具有代表性的一类L构型的核苷类化合物,研究发现抗病毒的效应是其D构型的对映异构体的50倍。推测β-L-D4A象其他的核苷类抗病毒药物一样,通过抑制HBV聚合酶功能来抑制HBV基因组的复制。为了证实这个推测需要进行进一步的实验。也需要进行进一步的研究来确定β-L-D4A是否对有拉米夫定抗性的病毒株有抑制效应,及这个化合物本身能否诱导HBV耐药株或突变株的出现。除此之外,还需要进行这个化合物的代谢、毒性和药代动力学方面的研究。我们的实验对β-L-D4A进行了初步的研究,证实β-L-D4A在体外具有抗HBV的效应,为将来的临床应用打下了基础。目的一些抗HBV的药物已经应用于临床,包括干扰素和核苷类药物如拉米夫定。当前抗HBV药物开发的热点集中于核苷类HBV聚合酶抑制剂的研究。HBV聚合酶有RNA依赖的逆转录、DNA依赖的DNA聚合和RNase H的功能,这种多功能的酶是核苷类抗病毒药物的作用靶点。beta-L-2’,3’-双脱氢-2’,3’-双脱氧呋喃腺嘌呤核苷-（β-L-D4A）是天然的脱氧腺嘌呤核苷的结构类似物,不同之处有两点,其一他们构型不同,天然的脱氧腺嘌呤核苷为D构型,第二个不同之处在于在β-L-D4A的戊糖环中,2’和3’碳原子间为双键,且3’碳原子上没有羟基。之前的研究表明在2.2.15细胞中,β-L-D4A能抑制HBV基因组的复制,降低细胞培养上清中HBsAg的含量。在转基因小鼠实验中,β-L-D4A能快速降低血清中HBV DNA和HBsAg含量,且没有明显的药物诱导的肝脏和肾脏毒性。推测象其他的核苷类抗病毒药物那样,β-L-D4A以其三磷酸化的形式（β-L-D4A-TP）通过抑制HBV聚合酶逆转录的活性来抑制HBV基因组的复制。在这项研究中,我们利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达重组HBV核心颗粒,体外进行聚合酶反应来研究β-L-D4A抑制HBV的的机制。方法构建重组质粒所需的外源片断是HBV聚合酶基因（pol基因）及HBV核心蛋白基因（core基因）片断。以含HBV全长基因组的质粒P3.6ll为模板PCR扩增目的基因片断。PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化扩增片断。将pol基因及core基因片断插入pFastBac Dual的两个多克隆位点,构建pFastBac Dual-pol-core重组质粒。重组克隆、质粒抽提、酶切反应、电泳鉴定、DNA片段回收、连接反应、大肠杆菌转化等均参考《分子克隆第三版》稍加修改进行。将pFastBac Dual-pol-core重组质粒转化含helper质粒与AcMNPV Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac。这样通过卡那霉素、庆大霉素与四环霉素三种抗生素筛选,同时辅以蓝白斑筛选,得到含聚合酶蛋白基因和核心蛋白基因的重组Bacmid DNA。行Bacmid小量提取,所得的重组Bacmid行PCR鉴定,鉴定正确的Bacmid转染Sf9细胞得到重组杆状病毒。以扩增的病毒感染昆虫细胞,细胞感染病毒3天后出现形态改变,倒置显微镜下可见转染Sf9细胞膨大、变圆,细胞折光性减低,胞内颗粒增大、增多,与正常Sf9细胞差别明显,可收集上清和病毒。同时收集未感染病毒的Sf9细胞及感染未重组的杆状病毒的细胞。三种细胞进行SDS-PAGE电泳,随后进行Western blot分析。分析正确的感染细胞用溴化氰活化的鼠抗HBV核心蛋白单克隆抗体偶联的Sepharose CL-4B进行免疫共沉淀纯化重组HBV核心颗粒。将40μl的偶联有免疫复合物的Sepharose重悬在100μl的反应体系中进行不同浓度药物干预下的体外聚合酶反应,用DIG-11-dUTP标记反应中生成的DNA链。对聚合酶反应中生成的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析。洗脱偶联在Sepharose上的核心颗粒,用酚氯仿抽提乙醇沉淀的方法抽提核心颗粒中的DNA,行琼脂糖凝胶电泳,继而用毛细管转移的方法转移到带正电荷的尼龙膜上,地高辛抗体杂交、显色。对聚合酶反应中生成的DNA-聚合酶复合物行SDS-PAGE分析,继而转膜、抗体杂交、显色。上述的两种方法提供了药物对聚合酶活性效应的定性分析,下面用实时荧光定量PCR的方法行定量分析。聚合酶反应后用上述的方法提取HBV核心颗粒中的DNA,用实时荧光定量PCR的方法测定提取的DNA的量。结果用酶切及测序的方法鉴定重组的pFastBac Dual-pol-core质粒构建成功,PCR鉴定重组Bacmid,所得的扩增片断与预期的结果相吻合。重组杆状病毒感染细胞3天后,倒置显微镜下可见转染Sf9细胞膨大、变圆,细胞折光性减低,胞内颗粒增大、增多,与正常Sf9细胞差别明显。SDS-PAGE电泳后,凝胶行银盐及考马斯亮蓝染色,以感染未重组杆状病毒的细胞作为对照,重组病毒感染的细胞在94kD及21kD处有强表达带,与预期的分子量大小相一致。Western blot结果证实所在位置处为HBV聚合酶蛋白和核心蛋白。在体外聚合酶反应中,地高辛标记的DIG-11-dUTP被掺入到新合成的DNA链中,作为在聚合酶反应中合成的DNA标记物。从琼脂糖凝胶电泳转膜显色图上可以看出从β-L-D4A-TP或3TC-TP的药物处理组的HBV核心颗粒中提取出的DNA量要少于未加药物的阴性对照组,而且随着药物浓度越高,DNA的量越少。这种结果提示类似于3TC-TP,β-L-D4A-TP能抑制重组核心颗粒中HBV DNA的复制,从而降低合成的DNA的量。聚合酶反应后,HBV核心颗粒在SDS及DTT存在情况下煮沸解离。当行SDS-PAGE电泳时,DNA-聚合酶共价结合物共同在胶上移行。在考马斯亮蓝染色及Westerm blot检测指示的HBV聚合酶所在位置处,有一条很浓的显色条带,在聚合酶位置处出现的标记显色表示在引物引发过程中共价结合到聚合酶上的第一个核苷酸,而在分子量更高位置处出现的标记显色表示逆转录过程中逆转录合成的DNA链的进一步延伸。随着β-L-D4A-TP或3TC-TP药物浓度的升高,在聚合酶反应中合成的DNA量减少。这个结果指示这些药物实际上是通过抑制聚合酶的逆转录功能从而导致DNA链合成的终止。为了对β-L-D4A-TP的抑制效应进行定量分析,我们采用荧光定量PCR的方法。计算抑制率,根据结果绘制抑制率曲线。用Reed-Muench方法计算β-L-D4A-TP和TC-TP的EC50分别为35.30umol/l和44.57urn/l。结论自从发现3TC-TP作为L构型的核苷类化合物对HIV和HBV有很强的抗病毒活性以来,药物化学家对L构型的核苷类化合物产生了浓厚的兴趣,合成了很多L构型核苷类化合物并对其进行了筛查。之前的研究发现与相应的D构型化合物相比较,绝大部分的L构型核苷酸类似物具有更强的抗病毒活性和更低的细胞毒性。我们利用重组HBV核心颗粒进行体外聚合酶反应来研究β-L-D4A-TP抗病毒作用的机理。这篇文章的研究表明β-L-D4A-TP以浓度依赖性的方式通过抑制HBV聚合酶逆转录活性来抑制HBV DNA的复制,但不能排除通过其他的抑制作用途径。推测类似于其他作用机理已阐明的核苷类逆转录酶抑制剂,因缺乏合成DNA链中磷酸二酯键所必需的核苷戊糖环上3’-OH,β-L-D4A-TP以链终止子的形式掺入到新合成的DNA链中从而导致链合成的终止。β-L-D4A-TP是dATP的结构类似物,动力学研究表明β-L-D4A-TP能与dATP竞争HBV聚合酶的结合位点。在此实验中β-L-D4A-TP和3TC-TP的EC50值分别为35.30umol/l和44.57umol/l,β-L-D4A-TP有着更强的抑制HBV DNA复制的效应。因为在治疗乙型肝炎过程中长期服用3TC产生的耐药现象日益严重,研制与开发新的高效低毒抗HBV药物已成为当务之急。我们的研究为将来β-L-D4A-TP的临床应用提供了实验依据。
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相关论文文献
- [1].新型核苷类似物β-L-D4A对人DNA聚合酶β和δ的作用及其机制[J]. 世界华人消化杂志 2008(06)
- [2].新型抗HBV化合物:-βL-D4A对DNA聚合酶δ的作用及其机制[J]. 胃肠病学和肝病学杂志 2008(04)