Riboswitch cDNA文库合成及分析

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从头合成（de novo synthesis）技术随着基因组数据库的日益丰富和DNA自动化合成效率的提高而快速发展,未来短期内通过合成基因的方法获得目标序列可能成为普通实验室的常规实验手段,而且合成技术将会逐步取代现有的重组手段。由传统碱基按序合成的方法来合成各种预期的基因或者基因组序列既浪费时间又浪费资金,且合成的目标序列出错率极高;目前虽然已开发芯片技术为大规模平行合成寡核苷酸提供了一种相对简单便捷的方法,但是,大多受到合成基因种类或实验条件等方面的限制而无法推广成为一种实验室常规合成方法。与常规利用芯片直接寡核苷酸、PCR组装基因不同,我们对寡核苷酸做了特殊的设计和改良,为寡核苷酸两端设计了带有平末端酶切位点的特异引物区,这不仅使得组装效率大幅度提高,并由常规的一次合成一种基因增加到同时合成多元基因。从芯片输出合成寡核苷酸后,经过回收和纯化,然后混合成为寡核苷酸混合物（OligoMix）;在OligoMix扩增及随后的组装中,获得相对保真的组装材料和较为稳定的体外组装条件,并且以此为基础,最终完成相关文库的建立。我们以核糖开关DNA序列（riboswitch cDNA）为例,分别设计了两套基因,一套长度小于100 nt在芯片上直接合成（SR）,一套通过寡核苷酸组装合成（LR）;并以直接测序结果作为依据,将每条测序结果与输出序列模板进行比对,统计分析碱基出错率。两套基因的综合出错率分别为2.58‰（SR）、2.37‰（LR）,分析碱基出错可能产生并积累于芯片原位合成及后续的PCR过程中,但比传统方法直接合成相应长度的序列出错率大为降低。再以合成的riboswitch cDNA序列作为模板进行体外转录,从而生产出毫克水平的riboswitch RNAs,并用RT-PCR产物验证还原性良好;通过对多元riboswitch cDNA体外转录条件的几个关键因素进行优化调整,获得了优化的体外转录条件,保证了后续实验（如配体结合实验,药物等方面开发实验）足够的实验材料。分析比较Mfold软件对不同riboswitch序列折叠取得的二级结构及测序结果,归纳出各种核糖开关适配体的关键保守序列,为预测发现新型核糖开关或丰富已发现核糖开关做了铺垫。从芯片产生的OligoMix到合成的完整的多元riboswitch,全部过程包括芯片输出设计寡核苷酸、PCR扩增富积（LR-OM PCR）、限制性酶切、组装和组装后扩增（F-PCR）、克隆、测序验证以及体外转录,全部过程可在一周内完成。这套合成条件经过优化,原来用于合成预期长度riboswitch的策略,同样可以被类似地应用合成任意基因序列。

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第一章适体、核糖开关及合成生物学研究进展

1 适体（Aptamer）

1.1 适体的发现和定义

1.2 适体的特点

1.3 适体与靶标分子相互作用简述

1.4 适体应用进展

2 核糖开关（Riboswitch）

2.1 核糖开关的发现、定义和特点

2.1.1 核糖开关的发现、定义

2.1.2 核糖开关一般特征

2.2 核糖开关分类

2.2.1 维生素相关核糖开关

2.2.1.1 焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate, TPP）

2.2.1.2 黄素单核甘酸（Flavin mononucleotide, FMN）

2.2.1.3 腺苷钴胺素（Adenosyl cobalymin, AdoCbl）

2.2.2 氨基酸相关核糖开关

2.2.2.1 硫-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl Methionine, SAM）

2.2.2.2 S-腺苷-l-高半胱氨酸（S-Adenosyl-l-Homocysteine, SAH）

2.2.2.3 赖氨酸（Lysine）

2.2.2.4 甘氨酸（Glycine）

2.2.3 嘌呤相关核糖开关

2.2.3.1 嘌呤（Purine）

2.2.3.2 环鸟苷二磷酸（Cyclic Di-Guanosine MonoPhosphate, Cyclic Di-GMP）

2.2.3.3 Q 核苷前体（PreQuosine, PreQ1）

2.2.4 核酶型相关核糖开关（葡萄糖胺-6-磷酸, Glucosamine-6-Phosphate, GlcN6P）

2.2.5 细胞内镁离子相关核糖开关

2.2.6 新型串联核糖开关

2.3 核糖开关调节机制

2.4 核糖开关分布

3 合成生物学

3.1 合成生物学定义

3.2 合成生物学意义

4 研究目的及内容

4.1 研究目的及意义

4.2 研究内容

第二章寡核苷酸与引物设计

1 材料与方法

1.1 材料与处理工具

1.2 Riboswitch 寡核苷酸设计方法举例

2 结果

2.1 核糖开关序列获得

2.2 核糖开关寡核苷酸引物设计

第三章体外获取多元Riboswitch cDNA 与RNA

1 材料与试剂

1.1 实验材料

1.2 处理工具

1.3 酶和试剂

2 方法

2.1 LR OligoMixs PCR 扩增

2.1.1 LR-OM PCR 扩增寡核苷酸丰度

2.1.2 MlyⅠ限制性酶切接头引物

2.1.3 MlyⅠ酶切后OligoMix 组装

2.1.3.1 缓慢降温法

2.1.3.2 热循环法

2.1.4 组装后片段PCR 扩增（F-PCR）

2.2 SR 全基因扩增（SRF-PCR）

2.3 组装产物克隆与测序

2.3.1 纯化组装产物接A 处理

2.3.2 连接

2.3.3 转化

2.4 质粒鉴定

2.4.1 碱裂解法提取质粒

2.4.2 质粒PCR 鉴定

2.5 序列测定与保真性分析

2.5.1 测序

2.5.2 测序结果分析方法

2.6 体外转录

2.6.1 体外转录DNA 模板准备

2.6.1.1 LR-DNA 体外转录模板准备

2.6.1.2 SR-DNA 体外转录模板准备

2.6.2 体外转录及条件优化

2.6.2.1 体外转录模板量条件优化

2.6.2.2 体外转录rNTP 量条件优化

2.6.2.3 体外转录M92+条件优化

2.6.3 转录后riboswitch RT-PCR 验证

2.7 Riboswitch 适体保守序列

2.7.1 文献提供结构

2.7.2 PreQ1-riboswitch 适体保守序列与结构模式预测

2.7.2.1 PreQ1-riboswitch 适体保守序列

2.7.2.2 PreQ1-riboswitch 适体结构模式

3 结果

3.1 LR OligoMixs PCR 扩增

3.2 LR-OM PCR 纯化产物Mly I 限制性酶切鉴定

3.3 体外组装

3.4 F-PCR 扩增组装产物切胶回收

3.5 组装产物克隆及序列分析

3.5.1 SR 克隆与序列分析

3.5.2 LR 克隆与序列分析

3.5.3 克隆与序列分析说明

3.5.3.1 克隆结果相关说明

3.5.3.2 序列分析说明

3.6 体外转录DNA 模板准备

3.7 体外转录条件优化

3.8 PreQ1-riboswitch 适体保守序列

3.9 PreQ1-riboswitch 适体结构模式

3.10 riboswitch 适体保守序列汇总

4 小结与讨论

4.1 体外组装核糖开关

4.2 体外转录

4.3 序列比对分析

第四章核糖开关相关文库构建

1 材料与处理工具

2 方法

2.1 寡核苷酸信息汇总

2.2 测序分析信息汇总

2.3 测序序列二级结构及相关序列信息汇总

2.4 测序样品储存信息汇总

2.5 排除序列相关信息汇总

3 结果

3.1 寡核苷酸信息表

3.2 测序分析信息表

3.3 测序序列二级结构及相关序列信息表

3.4 测序样品储存信息表

3.5 排除序列相关信息表

4 小结与讨论

总讨论

参考文献

致谢

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