DRC3f及eRF3b在肝病发生发展中作用机制的初步研究

论文摘要

全世界大概有3.6亿人口感染了乙型肝炎病毒,而长期慢性感染容易发生肝硬化,肝失代偿甚至诱发肝癌。尽管由于全球婴儿乙肝疫苗免疫计划的推行使得慢性肝炎发病率有所下降,但由于乙型肝炎病毒导致的肝癌的发病率至少在未来的20多年仍会上升。本室前期本着寻找早期生物标志物用于临床诊断的目的,应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）检测到两个小分子多肽,其中一个16个氨基酸的小肽经二级质谱鉴定为脱精氨酸补体C3f（DRC3f）,乙型肝炎的轻度及中度病人血清中表达量高于重度病人血清。补体系统是人体免疫很重要的组成部分,补体在外周血中以非活性形式存在,除了具有非特异性防御及参与机体的一系列特异性免疫应答外,在一些非免疫性因素的刺激下,补体亦可被活化产生炎症反应,并引起组织细胞损伤。补体中C3的含量最高,在补体激活过程中,C3活化形成的C3b进一步通过CR1或H因子帮助下由I因子分解为灭活的iC3b和17肽C3f。后者在羧基肽酶-N作用下脱精氨酸,迅速生成16肽DRC3f。许多研究表明,补体C3包括C3f及其一些片段在疾病进展中充当了重要角色。检测到的另一个37个氨基酸的多肽经鉴定属于真核肽链释放因子eRF3b,慢性肝炎患者血清中该多肽含量较高,肝癌及肝硬化病人血清中含量较低。真核生物中终止蛋白合成需要两类多肽释放因子,eRF1和eRF3。eRF1识别终止密码子,激发肽酰基tRNA链的水解,eRF3具有GTP酶活性,以GTP依赖的形式刺激eRF1释放因子的活性。哺乳动物中eRF3有两种,即eRF3a和eRF3b,各有637及628个氨基酸,分别由GSPT1和GSPT2编码,二者有87%的同源性。真核肽链释放因子eRF3除了在翻译终止过程中以GTP依赖的形式调节蛋白的合成外,还参与了调节细胞周期的转相,参与肿瘤的形成等,尽管机制不是很清楚。研究显示eRF3a是哺乳动物翻译终止过程中的主要因子,它的表达水平决定着终止复合物的形成,而且目前大多数研究都是针对eRF3a所进行的,但是在哺乳动物中,eRF3b可以实现eRF3a在翻译终止时的所有功能。第一部分脱精氨酸补体C3f（DRC3f）对体外肝细胞增殖的促进作用目的:作为补体激活的标志,补体C3f以及DRC3f可以作为肝脏损伤的一种生物标志物,可以为临床诊断提供参考,但其参与乙肝的病理变化的机制尚不清楚,因此本研究将对该多肽的作用机制做初步研究。方法:用含有DRC3f的血清以及固相合成的DRC3f刺激正常肝细胞QSG-7701,MTT法检测对肝细胞增殖的影响,并且提取RNA,采用实时荧光定量PCR方法分析细胞内转化生长因子TGFβ1以及一型胶原ColⅠ的表达情况。结果:轻、中、重度肝炎患者以及正常人的血清对QSG-7701细胞作用之后发现,轻度和中度肝炎血清对细胞刺激后的增殖较重度肝炎及正常血清快,F值为55.715,P<0.01。将血清用3Kd的超滤管超滤之后作用于细胞,可以观察到同样的效果,F值为26.325,P<0.01。为了进一步确认,本研究应用合成的DRC3f刺激QSG-7701细胞,同时以星状细胞LX-02作为对照,结果发现合成的DRC3f对肝细胞增殖有促进作用,对星状细胞影响不大。实时荧光定量测定结果显示,随着DRC3f的剂量的增加,TGFβ1和COLⅠ的表达下降,以18S rRNA为内参,与未刺激组比较,TGFβ1的表达为0.96（62.5 ng﹒mL-1组）、0.42（500 ng﹒mL-1组）;COLⅠ的表达为0.93（62.5 ng﹒mL-1组）、0.57（500 ng﹒mL-1组）。结论:DRC3f对肝细胞增殖有促进作用,并且随着剂量的增加,细胞因子TGFβ1和COLⅠ的表达下降。第二部分真核肽链释放因子eRF3b在人肝组织及体外肝细胞中的表达目的:在肿瘤形成过程中,肿瘤细胞的变化如蛋白合成率的增加、参与细胞周期增殖的某些特异蛋白的过表达往往和翻译因子的变化有关,一系列的证据支持真核翻译因子如翻译起始因子、延伸因子在肿瘤发生发展中的角色,但是关于释放因子的研究甚少,所以本研究将探讨真核肽链释放因子eRF3b在肝组织及不同细胞株的表达情况,为下一步机制研究奠定基础。方法:利用免疫组化法分析eRF3b在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,实时定量PCR中以18s rRNA为内参照,用2-△△Ct法对GSPT2、ERF1以及GSPT1在正常肝细胞QSG-7701、肝癌细胞HepG2、HBV整合的肝癌细胞HepG2.215中的mRNA水平进行分析,RIPA裂解细胞提取蛋白,以α-tublin为内参照,Western Blot检测eRF3b蛋白的表达水平。结果:4对肝组织标本（癌和癌旁组织）的免疫组化结果显示,eRF3b在实质细胞及间质细胞均有阳性表达,不同细胞株细胞爬片的免疫组化结果显示eRF3b在胞质表达;实时荧光定量PCR结果显示GSPT2在各细胞株的表达有所差异,在HepG2细胞中表达量高于QSG-7701以及HepG2.215细胞,而ERF1以及GSPT1在HepG2.215中表达量明显高于其他两种细胞株。Western Blot检测中,以α-tublin为内参照,肝癌细胞珠HepG2的相对表达量0.73,其它两个细胞株分别为0.25及0.24,eRF3b在HepG2中表达量高于其它两个细胞株,而QSG-7701与HepG2.215细胞中eRF3b表达量没有差异。结论:eRF3b在肝组织及培养的细胞株中阳性表达,以HepG2细胞株的表达较高。第三部分外源性eRF3b对HepG2细胞增殖及细胞周期的影响目的:通过上调或下调eRF3b在HepG2细胞中的表达进而对eRF3b在肿瘤发生发展中的作用进行初步研究。方法:构建绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111,瞬时转染至HepG2细胞,荧光显微镜观察蛋白的定位,同时构建短发卡干扰RNA的表达载体pSilencer2.1-GSPT2及pSilencer2.1-GSPT1,瞬时转染至HepG2细胞,pSilencer2.1-GSPT2转染组记为eRF3b（-）, pSilencer2.1-GSPT1转染组记为eRF3a（-）。转染不同重组质粒后应用Western Blot法观察目的蛋白表达量的变化,MTT比色法检测转染前后细胞活力变化,平板克隆形成试验分析eRF3b对单细胞克隆增殖的影响,流式细胞仪测定细胞周期的变化。结果:成功构建绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111,瞬时转染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察蛋白定位于胞质;细胞固定后,流式检测转染效率为65.1%,pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111的转染对细胞周期没有影响。shRNA表达质粒pSilencer2.1-GSPT2及pSilencer2.1-GSPT1进行测序证实构建成功,瞬时转染HepG2细胞,0 h、24 h及54 h分别收集细胞提取蛋白,Western blot测定,发现干扰54 h能够沉默58%左右的蛋白表达;MTT测定结果显示,eRF3b干扰组吸光度均值为0.1893（N=18）,eRF3a干扰组吸光度均值为0.147（N=18）,pSilencer对照组吸光度均值为0.259（N=18）,eRF3b干扰组及eRF3a干扰组细胞活力都较对照组下降,与eRF3b干扰组比较,eRF3a干扰组细胞活力较低;平板克隆形成实验结果表明eRF3b的缺失导致了细胞增殖能力的下降。流式细胞仪进行细胞周期分析,发现eRF3b的缺失导致了细胞周期的改变:与pSilencer对照组比较,eRF3b（-）组G1期细胞百分比由28.9%上升至65%,S期细胞百分比由41%减少至20.1%。结论:干扰GSPT2 mRNA表达后细胞周期改变,G1期细胞百分比增多,而且eRF3b的缺失导致了细胞的活力以及增殖能力下降,上述结果为了解eRF3b参与肝癌细胞增殖及细胞周期提供了分子基础,并暗示其可能为新的HCC治疗的靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 引言
• 第一部分 脱精氨酸补体C3f（DRC3f）对体外肝细胞增殖的促进作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 真核肽链释放因子eRF36 在人肝组织及体外肝细胞中的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 外源性eRF36 对HepG2 细胞增殖及细胞周期的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述一 真核肽链释放因子在酵母及高级真核生物的研究进展
• 参考文献
• 综述二 RNA 干扰技术的发展及其在肝病研究中的应用
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历