棉花中两个膜联蛋白基因功能初步分析

论文摘要

棉纤维是由胚珠外的单个表皮细胞分化发育而来的,棉纤维发育的各个时期中有多种不同的基因共同参与纤维形态的建成。因此明确棉花纤维发育相关基因功能不仅具有生产意义,而且有助于阐明单细胞发育的分子机理。棉花生活的环境中,常常遭受外界的各种危害,比如干旱、盐碱、低温、病虫害等都严重影响棉花的品质和产量,因此培育高抗性棉花品种是棉花育种工作的重要任务之一。膜联蛋白（annexin）是一类依赖Ca2+膜结合蛋白,广泛存在于除酵母外的真核生物细胞中,并且形成在进化上保守的多基因家族。在植物生长发育和应对环境胁迫和刺激的过程中起作用。我实验室前期从棉花高品质7235材料中克隆得到两个膜联蛋白基因（GhFAnn1和GhFAnnx）。本研究对这两个基因进行逆境诱导表达分析,同时通过构建不同类型正反义表达载体,获得了转这两个基因共六个载体的转基因纯系材料,为进一步阐明该类基因的作用机理奠定了基础。主要结果如下：对抗逆棉花品种晋棉19,进行各种非生物胁迫处理,包括冷害、PEG6000、NaCl、ABA和SA,采用实时荧光定量PCR方法分析两个膜联蛋白基因受非生物胁迫后的表达情况。结果显示GhFAnn1受干旱、冷害、ABA和SA诱导后表达强烈,而受NaCl诱导表达不强烈。GhFAnnx受PEG6000和SA诱导表达明显,受ABA诱导表达不明显,而受NaCl诱导表达下调。研究结果表明GhFAnn1和GhFAnnx基因都不同程度的参与了棉花对非生物胁迫的响应。利用已克隆的两个膜联蛋白基因构建了6个植物表达载体,进行转基因材料的培育,针对获得该基因的不同表达载体转基因纯系材料,分析了不同克隆纯系的表达特征和纤维品质检测结果。首先利用两个膜联蛋白基因（GhFAnn1和GhFAnnx）构建了6个不同植物表达载体,GhFAnn1基因正义表达载体（SAnn1）、反义表达载体（AsAnn1）和3‘端特异片段反义表达载体（3AsAnn1）。GhFAnnx基因正义表达载体（SAnn2）、反义表达载体（AsAnn2）和干扰载体（IAnn2）。进行棉花转基因材料培育,在前人研究获得部分转基因T1和T2代植株的基础上,进一步进行不同转基因克隆系的鉴定工作。经过PCR、卡那霉素抗性检测,共获得6个不同表达载体的多个克隆纯系,包括转GhFAnn1基因正义克隆14个纯系,反义克隆3个纯系,3’端特异片段反义克隆4个纯系；转GhFAnnX基因正义克隆6个纯系,反义克隆1个纯系,干扰克隆3个纯系。对转基因克隆纯系的纤维发育不同时期进行Q-PCR分析,SAnnl的克隆纯系中,克隆编号为2-2、110-2、84-3和80-1-1等4个克隆纯系表达量高于非转基因材料w0,克隆编号为57-1、77-1-2、96-2、110-4-2、110-6-2、110-7-3、107-4-1、107-5-1和107-7-1等9个克隆的纤维发育不同时期的表达量明显低于非转基因材料w0,推测目标基因在这些转基因材料中的表达受共抑制所致；AsAnnl纯系中克隆编号67-1、140-1和157-1等3个克隆的表达量与对照相近；3AsAnn1的4个纯系材料的表达量都低于非转基因材料WO。SAnn2的克隆纯系中,克隆编号32-1表达升高,而其他克隆材料的表达都受到抑制；AsAnn2的克隆纯系中中,克隆编号2-1ODPA时表达水平高于对照,而其他时期却低于对照；IAnn2的克隆纯系中,克隆编号2-1-1中的目标基因的在纤维中表达几乎被完全抑制,而83-1-3表达量增强,编号18-1在0DPA和5DPA时的表达升高,10DPA到20DPA表达却被完全的抑制了。目标基因在不同克隆载体的转基因纯系中,其表达特征仍需进一步验证。经过两年纤维品质检测结果表明,与对照相比,转SAnnl的纯合株系107-7-1和80-1-1棉纤维长度显著变长,马克隆值和比强度与对照相比也有显著变化。编号2-2、57-1、107-5-1和110-7-3的4个克隆的转基因材料纤维长度都明显变短,比强度没有明显变化,而其他转基因材料的各项纤维品质指标与对照没有显著变化。转AsAnnl各个纯和株系纤维长度没有明显的变化,其中,克隆67-1和157-1比强度和马克隆值与对照相比差异显著和极显著。3AsAnn1转基因材料中,克隆63-2纤维长度比对照显著变短,其他克隆的各项纤维品质指标没有明显变化。SAnn2转基因材料中,克隆编号42-1纤维长度比对照显著变短,其他克隆的纤维品质各项指标没有明显变化,AsAnn2转基因材料中,克隆2-1纤维长度比对照极显著变短,马克隆值和比强度没有变化,IAnn2转基因材料中的3个克隆的纤维长度都显著或极显著的变短。各转基因纯系材料纤维品质与基因表达关系还需要进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用缩略词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物应答非生物胁迫相关研究
• 1. 基因效应产物
• 2. 调控产物
• 第二章 植物膜联蛋白研究进展
• 1. 植物中膜联蛋白的发现
• 2. 植物膜联蛋白的结构及分布
• 2.1 植物膜联蛋白的结构
• 2.2 膜联蛋白在植物体内的分布
• 3. 植物细胞中膜联蛋白的功能
• 3.1 参与细胞分泌
• 3.2 参与钙离子代谢
• 3.3 参与抗寒反应
• 3.4 参与耐受盐胁迫
• 3.5 参与干旱胁迫
• 3.6 参与ABA信号转导
• 4. 膜联蛋白在棉花中的研究进展
• 第三章 棉花纤维发育研究
• 1. 纤维发育研究进展
• 1.1 纤维起始分化期
• 1.2 伸长期/初生壁形成期
• 1.3 次生壁合成期
• 1.4 成熟期
• 2. 纤维发育相关基因研究
• 3. 纤维发育相关基因功能研究进展
• 3.1 MYB基因在纤维发育中的作用
• 3.2 蔗糖合酶在纤维发育中的作用
• 3.3 细胞骨架蛋白在纤维发育中的作用
• 本研究目的和意义
• 第二部分 研究报告
• 第四章 膜联蛋白（Annexins）基因逆境表达分析
• 1. 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 网络资源和应用软件
• 1.3.1 网络资源
• 1.3.2 应用软件
• 1.4 用于定量的引物
• 2. 方法
• 2.1 植物材料胁迫处理
• 2.2 棉花总RNA的提取（CTAB-酸酚法）
• 2.3 DNaseI消化
• 2.4 cDNA第一链的合成
• 2.5 实时荧光定量PCR
• 3. 结果与分析
• 3.1 总RNA质量分析
• 3.2 GhFAnnl和GhFAnnx在胁迫诱导下的表达分析
• 3.2.1 GhFAnnl基因在逆境胁迫诱导下的表达分析
• 3.2.3 GhFAnnx基因在逆境胁迫下的表达分析
• 3.3 Annexins功能分析
• 4. 讨论
• 4.1 植物RNA质量要求
• 4.2 棉花膜联蛋白基因参与棉花的抗性反应
• 第五章 两个膜联蛋白基因转基因功能初步分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 引物
• 1.3.1 定量引物
• 1.3.2 载体引物
• 1.4 PCR检测
• 1.4.1 转基因植株DNA的提取
• 1.4.2 转基因植株的PCR检测
• 1.5 硫酸卡那霉素抗性检测
• 1.5.1 卡那霉素抗性植株的大田选择
• 1.5.2 利用卡那霉素对棉花转基因后代的快速筛选实验
• 1.6 转基因纯合株系纤维品质检测分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 不同表达载体转基因植株纯系的获得
• 2.2 GhFAnnl和GhFAnnx表达分析
• 2.2.1 GhFAnnl基因在TM-1中的表达特征
• 2.2.2 GhFAnnx基因在TM-1中的表达特征
• 2.3 GhFAnnl和GhFAnnx基因在转基因材料中的表达分析
• 2.3.1 GhFAnnl基因在正义表达载体转基因材料中的表达分析
• 2.3.2 GhFAnnl基因在反义表达载体转基因材料中的表达分析
• 2.3.3 GhFAnnl基因在3’特异片段反义表达载体转基因材料中的表达分析
• 2.3.4 GhFAnnx基因在正义表达载体转基因材料中的表达分析
• 2.3.5 GhFAnnx基因在反义表达载体转基因材料中的表达分析
• 2.3.6 GhFAnnx基因在干扰表达载体转基因材料中的表达分析
• 2.4 转基因植株纤维品质检测分析
• 2.4.1 GhFAnnl转基因材料纤维品质检测结果
• 2.4.2 GhFAnnx转基因材料纤维品质检测结果
• 3. 讨论
• 3.1 转基因棉花检测技术及纯系选育
• 3.2 Annexins基因在棉纤维发育中的可能功能
• 3.3 转基因棉花非生物胁迫研究展望
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢