论文摘要
DISC-1（Disrupted in scherophernia-1）基因最初被发现于一个有遗传性精神分裂症的苏格兰家族中,后来发现它还与抑郁症和躁狂症等许多精神性疾病相关。这一类患者往往还伴发有一种或多种先天性缺陷,这些缺陷是否也与DISC-1基因有关,目前尚不清楚。DISC-1基因定位在1号染色体的1q42区域,有13个外显子,长约200kb,编码一种含有854个氨基酸残基的蛋白质,它与许多细胞骨架蛋白有相互作用,这些细胞骨架蛋白可能在中心小体和微小管的功能、细胞迁移、神经突生长、受体的膜运输和线粒体的功能上起作用。2005年起,J.Kirsty Millar等在一系列研究中发现,在静息状态下,DISC1可以与PDE4B的UCR2部分结合,使其保持失活状态,而当细胞内cAMP水平升高时,PDE4B与DISC-1分离,从而被激活,使cAMP降解。提示DISC-1在cAMP的代谢中发挥着重要作用。作者所在实验室最近发现,缺氧预处理可以上调细胞内cAMP水平而抑制NF-κB介导的炎症反应,同时,在缺氧预处理后,DISC-1的蛋白表达水平也明显升高。缺氧预处理是目前对缺氧病理生理机制研究比较集中的热点之一,主要指在进行缺氧处理以前,对研究对象给予几次时间较短,程度较轻的“低氧-复氧-低氧-复氧”预适应处理。研究显示,缺氧预处理是一个复杂的,涉及多因素、多机制的保护过程。基于以上发现,可以推测,在缺氧预处理后,DISC-1蛋白表达水平的升高,可能参与缺氧预处理对组织和细胞的保护作用,其可能的机制是通过调节cAMP,抑制NFкB炎症通路。为证实上述推测,我们拟利用已建立的缺氧预处理动物及细胞模型,探讨:1、DISC-1对NFкB炎症通路是否有抑制作用;2、DISC-1抑制炎症的作用机制。实验方法和材料:1、细胞缺氧预处理模型的建立:细胞置于低氧密闭容器（2%O2）中缺氧45分钟,取出,置于正常氧环境（21%O2）中复氧20分钟,此为一个循环,重复3个循环。单纯缺氧组一直置于低氧密闭容器（2%O2）中,正常对照组则一直置于正常氧环境（21%O2）中。2、动物缺氧预处理模型的建立:C57BL/6小鼠或CD73基因缺陷小鼠随机分成3组,分别是正常对照组、单纯缺氧组和缺氧预处理组。缺氧预处理组小鼠被放置于可调节氧浓度的湿化密闭容器内,调节氧浓度到8%,维持10分钟,然后氧浓度转换为21%持续10min,如此循环3次。然后取出,置于正常氧环境（氧浓度21%）中2小时;单纯缺氧组小鼠也被放置同种容器内,调节氧浓度到8%,维持1小时,取出,置于常氧环境中2小时;正常对照组小鼠在正常氧环境中,不作任何处理。随后各组的小鼠均被置于容器内,调节氧浓度到5%,维持10分钟,致其死亡,手术取出肺组织,立即投入液氮快速冷冻,-80℃冰箱保存备用。3、DISC-1基因过表达（Over-expression）研究:将DISC-1质粒转染入Hela或HEK293细胞,然后进行缺氧预处理。4、DISC-1基因沉默研究:将DISC-1siRNA转染入Hela或HEK293细胞,然后进行缺氧预处理。5、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测DISC-1蛋白和PDE4B蛋白之间的结合能力。6、ELISA法检测细胞内cAMP水平。7、Western blot方法检测β-arrestin、PDE4B、p38MAPK等蛋白表达水平的变化。8、双荧光素酶报告分析（Dual luciferase reporter assay）检测NFкB活性:将pNF-κB-Luc（pNRE）质粒转染入Hela细胞,在缺氧预处理后,继续缺氧24小时,然后检测Luciferase强度,即NFкB活性。9、RT-PCR检测PDE4B、白介素-6（IL-6）mRNA水平10、免疫荧光染色检测NFкB核移位率研究结果:1、在缺氧预处理后,细胞内DISC-1 mRNA和蛋白水平均明显升高。2、在缺氧预处理后,细胞内DISC-1蛋白水平的升高与腺苷通路有关。3、免疫共沉淀实验证实在HEK293细胞中,DISC-1蛋白和PDE4B蛋白能相互结合。4、过表达DISC-1基因的细胞在缺氧时NFкB活性及IL-6的转录水平均明显低于对照组,表现出类似于缺氧预处理的保护效果。5、DISC-1基因被沉默后,缺氧预处理对细胞NFкB活性及IL-6转录水平的抑制作用减弱,丧失了对细胞的保护效果。6、在受到相同的Forskolin刺激后,过表达DISC-1基因的细胞cAMP水平明显高于正常组及DISC-1基因沉默组;DISC-1基因沉默组细胞cAMP水平显著低于正常组及过表达组。7、过表达DISC-1基因的细胞在缺氧时p38MAPK磷酸化受到抑制;而DISC-1基因沉默后,缺氧预处理对细胞p38MAPK磷酸化的抑制作用减弱。8、过表达DISC-1基因的细胞在缺氧时IκBα的磷酸化受到抑制;而DISC-1基因沉默后,缺氧预处理对细胞IκBα的磷酸化的抑制作用减弱。结论:DISC-1能有效地抑制缺氧条件下NF-κB介导的炎症反应,是一种新发现的具有抗炎作用的基因。其参与缺氧预处理抗炎作用的机制如下:1、缺氧预处理可以通过腺苷相关通路,提高细胞内DISC-1基因的转录及蛋白表达水平。2、DISC-1能通过与PDE4B蛋白的结合,促进细胞内cAMP水平的升高,并通过cAMP-PKA-CREB-p38MAPK通路,阻止p65亚基在核内的磷酸化,从而抑制NF-кB介导的炎症反应。3、DISC-1还可以通过阻止IκBα的磷酸化和降解,从而抑制NF-кB的激活,但其作用于IκBα的具体机制还有待进一步研究。氯胺酮是一种在临床上大量使用的麻醉药物,在婴幼儿的麻醉中使用尤其广泛。近年来的研究发现,在未成熟大脑的快速发育期（人类为胚胎晚期到3岁）,使用氯胺酮,可以导致神经细胞的大量凋亡。这引起了人们对其临床使用的安全性,尤其是在婴幼儿中的安全性的注意。氯胺酮是N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体非竞争性拮抗剂。其诱导未成熟神经细胞凋亡的机制,目前尚未完全研究清楚,一般认为与其对NMDA受体的拮抗导致的钙离子内流异常升高有关。细胞周期素D1（Cyclin D1）是细胞周期的重要调节蛋白,主要调控细胞从G1期到DNA合成期———S期的过渡。有研究发现,Cyclin D1对细胞周期的异常启动,是导致神经细胞凋亡的重要机制之一。近来,有研究提示,Cyclin D1可能参与氯胺酮诱导未成熟神经细胞凋亡的过程。这些研究发现,氯胺酮可以促进神经细胞NFκB从细胞浆转移入细胞核,发挥其作为转录调节因子作用。而Cyclin D1基因中包含有NFκB启动子,提示Cyclin D1基因可能作为下游目标受到NFκB的转录调节。基于这些发现,我们推测,除了钙离子内流异常升高外,Cyclin D1对细胞周期的异常启动,可能也是氯胺酮诱导未成熟神经细胞凋亡的机制之一。为证实这一推测,我们利用原代培养的孕龄18天的胎鼠皮质神经细胞作为体外模型,以及出生后7天的新生鼠作为体内模型,研究氯胺酮诱导未成熟神经细胞的凋亡的效应及机制。方法:1、体内模型（P7新生幼鼠）:出生7天的新生幼鼠2、体外模型（E18细胞）:原代培养孕龄18天胎鼠皮质神经细胞3、氯胺酮给药方法:3.1体内实验:经腹腔注射5～20mg/kg体重,每90分钟注射一次,共注射4次。经过6小时的处理后,幼鼠被给予戊巴比妥（100mg/kg,经腹腔注射）处死,手术取出大脑,立即投入液氮快速冷冻,用于Western blot检测;或4%多聚甲醛固定,石蜡切片用于免疫组织化学的检测。3.2体外实验:E18细胞铺于培养板中,24小时后,更换培养液为新鲜配制的含100nM-1mM氯胺酮的培养液。放回细胞培养箱中继续培养6-48小时,分别进行免疫化学染色、MTT检测以及提取总蛋白用于Western blot检测。4、检测方法:4.1 Tuj1免疫荧光染色鉴定E18细胞4.2免疫组织化学检测细胞凋亡的标志----Cleaved caspase-3的表达4.3 MTT法检测氯胺酮对E18细胞的毒性4.4 Western blot检测P7新生幼鼠脑组织及E18细胞中的Cylin D1、Cleaved Caspase-3、Bim等蛋白的表达情况结果1、Tuj1免疫荧光染色鉴定E18细胞中,神经细胞比例占总数的90%以上。2、氯胺酮在10mg/kg水平,对P7新生幼鼠作用6小时,开始出现明显的神经细胞凋亡（检测到Cleaved caspase-3的表达）,凋亡水平的增加呈剂量依赖性。3、氯胺酮在10uM水平对E18细胞作用6小时,开始出现E18细胞凋亡（检测到Cleaved caspase-3的表达）,凋亡水平的增加呈剂量及时间依赖性。4、氯胺酮在10uM水平对E18细胞作用48小时,MTT可检测到较明显的细胞数量减少。5、氯胺酮可以引起P7新生幼鼠脑组织及E18细胞中Cylin D1表达增加,增加方式呈剂量及时间依赖性。6、氯胺酮可以引起P7新生幼鼠脑组织及E18细胞中E2F1表达增加,增加方式呈剂量及时间依赖性。7、氯胺酮可以引起P7新生幼鼠脑组织及E18细胞中Bim表达增加,增加方式呈剂量及时间依赖性。结论1、氯胺酮在一定的剂量及作用时间下,能显著地诱导P7新生幼鼠大脑未成熟神经细胞凋亡。2、氯胺酮在一定的剂量及作用时间下,能显著地诱导体外培养的未成熟神经细胞（E18原代培养皮质神经细胞）凋亡。3、Cylin D1/ Cdk4- E2F1-Bim-Cleaved Caspase-3通路可能参与了氯胺酮诱导大鼠体内及体外模型中未成熟神经细胞凋亡的过程。近年来的研究发现,在未成熟大脑的快速发育期使用氯胺酮（Ketamine）、异氟醚（Isoflurane）等麻醉药物可以导致神经细胞的大量凋亡。这引起了人们对其临床使用的安全性,尤其是在婴幼儿中的安全性的注意。最近,Anand等在对氯胺酮的效应进行研究时发现,如果同时给予炎症性及疼痛刺激,氯胺酮所诱导的大鼠的皮层和皮层下神经细胞的凋亡率明显下降。提示,在疾病状态下,氯胺酮、异氟醚等药物诱导未成熟神经细胞凋亡的作用与正常状态下有差异。为探讨这一差异,我们拟利用弗氏完全佐剂（Complete Freund’s Adjuvant,CFA）刺激P7新生幼鼠,造成疼痛和急性炎症,作为病理状态的模型,与正常P7新生幼鼠对比研究氯胺酮以及异氟醚诱导未成熟神经细胞凋亡作用的差异,以及造成这一差异的可能机制。实验方法:1、大鼠急性疼痛和炎症模型:麻醉后,P7新生幼鼠的双后爪掌面,均皮下注射CFA（0.1mlCFA/爪）,对照组注射等量生理盐水2、实验分组:氯胺酮对照组:氯胺酮腹腔注射（20mg/kg）,双后爪掌面注射生理盐水,每90分钟重复注射氯胺酮一次,共注射4次氯胺酮+CFA组:氯胺酮第一剂量起效后,双后爪掌面注射CFA,余同上异氟醚对照组:1%异氟醚麻醉,起效后,双后爪掌面注射生理盐水异氟醚+CFA组:1%异氟醚麻醉,起效后,双后爪掌面注射CFA CFA对照组:双后爪掌面注射CFA正常对照组:不做任何处理3、检测方法3.1免疫组织化学检测细胞凋亡的标志----Cleaved caspase-3的表达3.2 Western blot检测P7新生幼鼠脑组织Cleaved Caspase-3以及Cylin D1、E2F1、Bim等蛋白的表达情况结果:1、CFA注射后均引起了局部红、肿、发热等炎症反应2、氯胺酮+CFA组脑神经细胞凋亡水平明显低于氯胺酮对照组3、异氟醚+CFA组脑神经细胞凋亡水平明显低于异氟醚对照组4、氯胺酮+CFA组脑组织中Cylin D1、E2F1、Bim等蛋白表达水平明显低于氯胺酮对照组5、异氟醚+CFA组脑组织中Cylin D1、E2F1、Bim等蛋白表达水平明显低于异氟醚对照组6、异氟醚对照组Cylin D1、E2F1、Bim等蛋白的表达水平明显高于正常对照组结论:1、CFA注射能有效引起局部急性炎症反应,可以作为急性炎症模型进行研究。2、异氟醚诱导未成熟神经细胞凋亡的作用可能也与Cyclin D1/cdk4-E2F1-Bim通路有关。3、CFA能有效减弱氯胺酮诱导未成熟神经细胞凋亡的作用4、CFA能有效减弱异氟醚诱导未成熟神经细胞凋亡的作用5、CFA可能通过抑制Cyclin D1/cdk4-E2F1-Bim通路,从而减弱氯胺酮、异氟醚诱导未成熟神经细胞凋亡的作用
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