原癌基因c-myc RNA干扰对细胞周期的影响

论文摘要

c-myc是永生性癌基因,在细胞的生长、繁殖、凋亡及分化中具有极重要的地位。c-myc的过度表达是人类癌症细胞最常见的变化之一,是细胞恶性转化的关键基因。本研究用阳离子脂质体转染法首次将针对c-myc mRNA的SiRNA表达质粒pSilencer-c-myc转染人肺癌细胞A549,72h后收获细胞,RT-PCR检测结果表明,干扰细胞c-myc mRNA水平降低至40%左右,WestemBlotting分析表明其蛋白水平约降低了70%,说明RNA干扰成功。 应用流式细胞术研究c-myc表达水平降低对A549细胞周期的影响。结果表明,与对照细胞相比,RNA干扰72h后G0/G1期细胞比例由51.5±1.7%下降到35.1±1.1%,下降16个百分点,S期细胞由41.3±1.4%上升至55.1±1.6%,提高14个百分点,G2/M期则无明显差异（p>0.05）,显示针对c-myc的RNA干扰引起S期阻滞。 为了探明c-myc RNAi引起S期阻滞的作用途径与机制,分析了细胞周期相关基因的mRNA水平,包括cyclin、CDK和CKI。试验结果显示,干扰72h后,干扰细胞与对照细胞比较:1) 细胞周期素cyclin D3、E、A的mRNA水平均出现不同程度的下降（p<0.05）,分别下降了22±8%、30±2%和45±7%,cyclin D1则无明显变化（p>0.05）;2) CDK2、CDK4 mRNA水平下调（p<0.05）,分别下降了44±4%、39±4%;3) 细胞周期素依赖性抑制因子p21及p27的mRNA水平上升,各提高了36±6%、44±8%。 为了探明蛋白水平与mRNA水平的对应关系,运用WesternBlotting,分忻了Cyclin及CDK的蛋白水平。结果表明干扰72h后,干扰细胞与对照细胞比较,Cyclin D3、E、A,CDK2、4等的mRNA下调直接导致其蛋白水平的下降（p<0.05）,分别下降42±5%、41±2%、57±5%和56±9%、36±5%。Cyclin D1无明显变化（p>0.05）。 综上所述,c-myc RNAi后,c-myc表达降低,对cyclin和CDK激活作用减弱,同时对CKI的抑制效应也降低,延缓DNA复制,引起细胞周期的S期阻滞,限制恶性癌细胞生长。因此c-myc的RNAi作为一种基因治疗手段,显示良好的前途。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 第一章 绪论
• 1 细胞周期与癌变
• 1.1 细胞周期
• 1.2 细胞周期素
• 1.3 细胞周期素依赖性激酶
• 1.4 细胞周期素依赖性激酶抑制因子
• 1.5 细胞周期与癌变
• 2 原癌基因 c-myc
• 2.1 c-Myc 的结构
• 2.2 c-Myc 与细胞增殖
• 2.3 c-Myc 与细胞凋亡
• 2.4 c-myc 癌基因的转录激活功能
• 2.5 c-Myc 的转录抑制功能
• 2.6 c-myc 的激活与肿瘤
• 3 RNAi技术
• 3.1 RNAi介绍
• 3.2 RNAi研究进展
• 3.3 RNAi的应用
• 3.4 RNAi应用于c-myc基因的研究
• 3.5 RNAi应用于A549细胞的研究
• 4 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 质粒及其宿主菌
• 1.2 细胞
• 1.3 主要试剂
• 1.4 溶液配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 质粒DNA制备
• 2.2 细胞准备
• 2.3 脂质体介导质粒DNA转染细胞
• 2.4 流式分析细胞处理
• 2.5 RT-PCR
• 2.6 SDS-PAGE与免疫印迹
• 第三章 结果与分析
• 1 质粒pSilencer-c-myc DNA 鉴定结果
• 1.1 完整性
• 1.2 纯度
• 1.3 酶切鉴定
• 2 RNAi对c-myc基因表达的影响
• 2.1 c-myc mRNA水平变化
• 2.2 c-myc蛋白水平变化
• 3 RNAi对细胞周期的影响
• 4 RNAi对细胞周期相关基因mRNA水平的影响
• 4.1 cyclin mRNA水平
• 4.2 CDK mRNA水平
• 4.3 p21及p27 mRNA水平
• 5 RNAi对细胞周期相关基因蛋白水平的影响
• 5.1 细胞周期素蛋白水平
• 5.2 细胞周期素依赖激酶蛋白水平及变化
• 第四章 讨论
• 1 RNAi对c-myc基因表达的影响
• 2 c-myc RNAi对细胞周期的影响
• 3 RNAi对cyclin表达水平的影响
• 4 RNAi对CDK表达水平的影响
• 5 RNAi对p21及p27mRNA水平的影响
• 6 小结
• 第五章 结论与建议
• 1 结论
• 2 建议
• 参考文献
• 致谢