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简单节杆菌与分枝杆菌3-酮基甾体-1（2）位脱氢酶的克隆表达

2020-12-25阅读(951)

简单节杆菌与分枝杆菌3-酮基甾体-1（2）位脱氢酶的克隆表达

论文摘要

在甾体医药工业中,微生物催化的3-酮基甾体-1（2）脱氢反应十分重要,是制备高抗炎活性肾上腺皮质激素的关键反应,可使甾体药物的抗炎活性成倍增加。本课题从工业用菌简单节杆菌（Arthrobacter simplex）以及具有高活性3-酮基甾体-1（2）脱氢活性的一株分枝杆菌（Mycobacterium sp.）中获得了起3-酮基甾体-1（2）脱氢作用的C1,2位脱氢酶（KSDD）,并在大肠杆菌进行了克隆表达,对两者的酶活进行了初步的比较。首先,根据NCBI中的Arthrobacter simplex碱基序列设计引物,获得了分枝杆菌KSDD基因全序列,与NCBI中报道的序列一致。其次,分析已知分枝杆菌的KSDD碱基序列,设计简并引物,以本实验室筛选的一株分枝杆菌基因组DNA作模板,得到一个1500bp的KSDD基因片段,通过染色体走读的方法,得到其完整的阅读框。分析表明,该基因包含开放性阅读框1701bp,编码567个氨基酸,与Mycobacterium smegmatis str. MC2155 （Genbank CP000480）的KSDD基因部分同源性达到82%。首先由pET22构建pTQ004与pTQ005作为表达载体,在E.coliBL21（DE3）/plysS中分别对两个KSDD进行了异源表达。转化子经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明表达出蛋白为包涵体,酶活在误差限左右。随后,由带有弱启动子的pUC18构建了pTQ002与pTQ003作为表达载体,在E.coliDH5α中分别对两个KSDD进行了异源表达。转化子经IPTG诱导,在30°C的水浴中测定酶活,Arthrobacter simplex的KSDD酶活为0.82±0.09 U,Mycobacterium sp.的KSDD酶活为0.37±0.05U。pUC18为弱启动子,表达量很少,在蛋白电泳中看不到条带。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 甾体化合物及甾体药物
  • 1.2 甾体化合物的微生物转化
  • 1.3 3-酮基甾体-1（2）位脱氢反应的研究进展
  • 1.3.1 3-酮基甾体-1（2）位的脱氢机理
  • 1.3.2 3-酮基甾体-1（2）脱氢酶的氨基酸序列对比
  • 1.3.3 3-酮基甾体-1（2）脱氢酶的异源表达
  • 1.4 本课题的研究目的与内容
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 培养基
  • 2.1.2 菌株培养条件
  • 2.1.3 主要试剂
  • 2.1.4 菌株和质粒
  • 2.1.5 引物序列
  • 2.1.6 实验主要仪器
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
  • 2.2.2 细菌总DNA的抽提
  • 2.2.3 限制性内切酶酶切反应
  • 2.2.4 DNA连接反应
  • 2.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳
  • 2.2.6 细菌质粒DNA的抽提
  • 2.2.7 DNA的保存
  • 2.2.8 PCR扩增反应
  • 2.2.9 Genome-Walking克隆基因基本步骤
  • 2.2.10 分枝杆菌基因组的提取
  • 2.2.11 外源基因在大肠杆菌E.coliDH5α中的诱导表达
  • 2.2.12 SDS-PAGE检测表达蛋白
  • 2.2.13 一位脱氢酶酶活单位定义及酶学性质分析
  • 2.2.14 外源基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）/plysS中的诱导表达
  • 第三章 结果与讨论
  • 3.1 简单节杆菌一位脱氢酶基因
  • 3.1.1 简单节杆菌基因组的提取
  • 3.1.2 简单节杆菌3-酮基甾体-1（2）脱氢酶基因的PCR,克隆
  • 3.1.3 分枝杆菌一位脱氢酶PCR扩增、克隆以及序列分析
  • 3.2 分枝杆菌一位脱氢酶全片段的获得
  • 3.2.1 分枝杆菌基因组提取方法改进
  • 3.2.2 分枝杆菌3-酮基甾体-1（2）脱氢酶全序列的获得
  • 3.2.3 全长Mycobacterium sp.3-酮基甾体-1（2）脱氢酶基因的克隆
  • 3.3 Mycobacterium sp.3-酮基甾体-1（2）脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达
  • 3.3.1 大肠杆菌表达载体pHZ1272的构建
  • 3.3.2 由pET-22构建表达载体
  • 3.3.3 3-酮基甾体-1（2）脱氢酶基因在E coli BL21（DE3）/plysS中的表达
  • 3.3.4 E.coliBL21（DE3）/plysS中甾体一位脱氢酶的酶活测定
  • 3.3.5 由pUC18构建表达载体
  • 3.3.6 3-酮基甾体-1（2）脱氢酶基因在E coli DH5α中的表达
  • 3.3.7 E coli DH5α中甾体一位脱氢酶的酶活测定
  • 小结
  • 第四章 结论与展望
  • 4.1 结论
  • 4.1.1 简单节杆菌KSDD的PCR与分枝杆菌脱氢酶保守区的PCR
  • 4.1.2 Mycobacterium sp.染色体的走读
  • 4.1.3 简单节杆菌与分枝杆菌KSDD在E.COliDH5α表达
  • 4.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

    • 相关论文文献

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