轮枝镰孢的荧光标记及其在寄主—病原菌互作中的应用

论文摘要

玉米茎腐病在中国乃至全世界玉米生产区都有普遍发生。近年来,受耕作制度(如保护性耕作、秸秆还田等)的改变和气候变化的影响,我国玉米茎腐病的发生正逐渐加重。玉米茎腐病的主要致病菌之一轮枝镰孢[Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg]不仅能侵染玉米的根、茎和穗,引起苗枯病、茎腐病和穗腐病,还能像内生菌那样既能定殖于植株体内又不引起病症。本研究采用农杆菌介导法将红色荧光蛋白基因DsRed转入轮枝镰孢FV菌株,通过对转化子的生理生化等分析筛选到与野生菌差异最小的转化子进行后续分析。主要结论如下:农杆菌介导法能够将GFP和DsRed荧光蛋白标记基因随机插入轮枝镰孢的基因组内,且外源基因的差异多为单拷贝随机插入。对转化子进行生理生化等指标的测定,发现DsRed更易导致突变体的出现。采用农杆菌介导法将红色荧光蛋白基因DsRed转入轮枝镰孢FV菌株,利用荧光显微镜观察轮枝镰孢在玉米感抗自交系根部定殖和生长的规律。在感病材料中土壤中的轮枝镰孢首先从须根开始,它们可以在须根中大量定殖而不使须根致死。所以须根在轮枝镰孢侵染玉米以及玉米抗侵染方面可能起着关键作用,特别是在侵染的早期。随后轮枝镰孢沿主根向上侵染,以菌丝的形式扩展到地上组织。有些孢子附着在根表皮的纹理中,萌发形成菌丝而扩展;有的则向内侵染附着的细胞,然后再继续向周边侵染。由根内部向上侵染的菌丝多沿着细胞间隙上行,有些也会穿行在不同细胞之间。轮枝镰孢在侵染感病玉米有时会形成马赛克结构,而且这种马赛克结构在后期菌丝充满整个植物细胞时,会造成细胞的死亡。菌丝通常会定殖在须根下面或附近的细胞中。而在抗病玉米材料中,其须根数量明显低于感病材料,而且会形成坏死斑以限制轮枝镰孢的扩展。分析接种不同时间轮枝镰孢在玉米根和茎基部组织形成的单菌落数量(CFU)发现,轮枝镰孢在根部的CFU值随时间逐渐减小,而茎基部的CFU值则呈逐渐增大的趋势。这说明土壤中的轮枝镰孢能够通过对根系的系统侵染途径危害地上部组织。在抗病材料中根部和茎基部的CFU值都低于感病材料。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写英文全称中文全称
• 第一章 绪论
• 1.1 玉米茎腐病主要致病菌-轮枝镰孢
• 1.2 轮枝镰孢的研究进展
• 1.3 荧光蛋白在致病研究中的应用
• 1.3.1 绿色荧光蛋白（GFP）
• 1.3.2 红色荧光蛋白（DsRed）
• 1.3.3 荧光蛋白的结构和性质
• 1.3.4 荧光蛋白在植物病理学研究中的应用
• 1.4 丝状真菌的遗传转化
• 1.4.1 丝状真菌转化载体
• 1.4.2 丝状真菌遗传转化系统的选择标记
• 1.4.3 丝状真菌的遗传转化方法
• 1.4.4 根瘤农杆菌介导的遗传转化法
• 1.4.4.1 农杆菌的生物学特性
• 1.4.4.2 农杆菌的分类
• 1.4.4.3 农杆菌Ti 质粒的结构
• 1.4.4.4 根癌农杆菌介导受体遗传转化的机理
• 1.4.4.5 根癌农杆菌介导丝状真菌转化的特点
• 1.5 轮枝镰孢侵染玉米的研究进展
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 农杆菌介导的轮枝镰胞菌转化
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 菌株和质粒
• 2.1.1.2 培养基和培养条件
• 2.1.1.3 抗生素配制及使用浓度
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 筛选转化子所需潮霉素B 浓度的确定
• 2.1.2.2 真菌的遗传转化
• 2.1.2.2.1 农杆菌的准备
• 2.1.2.2.2 轮枝镰胞菌的准备
• 2.1.2.2.3 共培养
• 2.1.2.2.4 阳性转化子的筛选
• 2.1.2.2.5 突变体单菌落的获得
• 2.1.2.3 突变体的分子鉴定
• 2.1.2.3.1 总DNA 快速提取
• 2.1.2.3.2 突变体的PCR 检测
• 2.1.2.4 转化子的遗传稳定性验证
• 2.1.2.5 转化子的荧光表达观察
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 轮枝镰孢FV 潮霉素抗性实验
• 2.2.2 轮枝镰孢转化子的获得
• 2.2.3 轮枝镰孢转化子PCR 验证
• 2.2.4 轮枝镰孢转化子遗传稳定性的鉴定
• 2.2.5 轮枝镰孢转化子荧光显微观察
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 转化子插入突变分析
• 3.1 材料方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 突变体的生长特性
• 3.1.2.2 突变体产孢量的测定
• 3.1.2.3 转化子胞外酶的代谢检测
• 3.1.2.4 突变体产生毒素（FB、DON）的检测
• 3.1.2.5 致病性试验
• 3.1.2.6 实验设计和数据统计分析
• 3.1.3 结果
• 3.1.3.1 突变体在不同pH 值培养基上的生长
• 3.1.3.2 突变体相对于野生菌产孢量的变化
• 3.1.3.3 转化子胞外酶的代谢检测
• 3.1.3.4 突变体产生毒素（FB、DON、Zen、T-2）的检测
• 3.1.3.5 致病性试验
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 荧光标记的真菌在寄主根际定殖的研究
• 4.1 材料方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 供试菌株和作物
• 4.1.1.2 孢子悬浮液的配制
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 种子表面处理
• 4.1.2.2 轮枝镰孢FV-DsRed 菌剂的制备
• 4.1.2.3 轮枝镰孢对玉米侵染的观察
• 4.1.2.4 轮枝镰孢在组织中定殖相对量检测
• 4.1.3 结果与分析
• 4.1.3.1 轮枝镰孢在玉米根系的系统侵染与定殖
• 4.1.3.1.1 轮枝镰孢引起玉米根系组织病变与菌丝的定殖
• 4.1.3.1.2 轮枝镰孢在玉米根组织中的系统扩展
• 4.1.3.2 轮枝镰孢在玉米上定殖的定量分析
• 4.1.4 讨论
• 4.1.5 小结
• 第五章 轮枝镰孢在感抗玉米根部的定殖研究
• 5.1 材料方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 供试菌株和作物
• 5.1.1.2 接种液的配制
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 种子表面处理
• 5.1.2.2 轮枝镰孢FV-DsRed 菌剂的制备
• 5.1.2.3 轮枝镰孢对玉米侵染的观察
• 5.1.2.4 轮枝镰孢在组织中定殖相对量检测
• 5.1.2.5 轮枝镰孢菌的侵染玉米根部引起的PCD 分析
• 5.1.2.6 玉米根部淀粉含量及pH 的测定
• 5.1.3 结果与分析
• 5.1.3.1 轮枝镰孢在玉米（感抗）根部的定殖
• 5.1.3.2 轮枝镰孢在玉米须根的定殖
• 5.1.3.3 轮枝镰孢在玉米（感抗）根系上定殖的定量分析
• 5.1.3.4 ELISA 法测定伏马毒素在玉米根部的积累
• 5.1.3.5 DAB 染色法
• 5.1.4 讨论
• 5.1.5 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 论文发表与参加科研情况说明
• 致谢