蛇床子素在大鼠原代肝细胞中代谢的研究

论文摘要

目的采用大鼠原代肝细胞体外温孵液对蛇床子素（Ost）在肝细胞中代谢转化过程进行研究。分析Ost在大鼠肝细胞中的代谢途径和机制,探讨Ost在CYP450酶系相关亚型中的代谢,及CYP450酶诱导剂和抑制剂对Ost代谢的影响。为更深入地研究Ost的药动学及其临床上合理用药提供理论和实验依据。方法①建立大鼠原代肝细胞的分离方法和大鼠肝细胞体外温孵体系。通过台盼蓝排斥实验、光学显微镜、透射电镜检查、HE染色对肝细胞的产率,活力,细胞的形态、超微结构等指标进行测定。②通过MTT方法测定不同浓度Ost对大鼠原代肝细胞活力的影响。③建立Ost的HPLC-UV检测方法。④通过温孵时间、肝细胞含量、底物浓度三个方面来考察Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中的酶促动力学特征。⑤研究CYP3A4诱导剂利福平（Rif）、CYP2D6抑制剂育亨宾（Yoh）、CYP2C9抑制剂磺胺嘧啶（Sul）、CYP2C8抑制剂槲皮素（Que）对Ost在大鼠肝细胞温孵液中代谢的影响。⑥选择CYP3A4特异性抑制剂醋竹桃霉素（Tro）,观察其对Ost体外代谢的抑制效应。结果①建立了成熟的大鼠原代肝细胞的分离方法和大鼠原代肝细胞温孵体系,肝细胞产率为1-2x108/肝,肝细胞活力和纯度均在90%以上。②Ost的浓度在0-20μM范围内对大鼠原代肝细胞活力与空白对照组相比,未见显著影响,肝细胞活力>80%。③Ost的HPLC检测方法为流动相:甲醇:双蒸水=80:20（V/V）;流速:1.0 ml/min;检测波长:322nm;灵敏度:0.004 Aufs。④Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中呈现明显的酶促动力学特征:当Ost的浓度在0-10μM,Ost的代谢呈浓度依赖性,代谢消除量随底物浓度增加呈线性增加;当浓度超过10μM,Ost代谢出现饱和现象,代谢消除量不再随着底物浓度的增加而增加。Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中经37℃空气浴振荡器振荡孵育15～120min,呈时间依赖性线性消除。温孵液中肝细胞的浓度在5x105～1x107/ml范围内,Ost的代谢量随肝细胞浓度增加而增加,呈线性消除。⑤CYP2D6抑制剂Yoh、CYP2C9抑制剂Sul、CYP2C8抑制剂Que对Ost的代谢消除率的影响与对照组相比无明显区别（P>0.05）,在与CYP3A4诱导剂Rif共孵育的肝细胞温孵液中Ost的代谢消除率与对照组相比具有显著性差异（P<0.05）。⑥CYP3A4抑制剂Tro呈剂量依赖性抑制Ost在大鼠肝细胞中的代谢。结论本实验建立的大鼠原代肝细胞分离方法和肝细胞体外温孵液稳定、可靠,能满足本实验药物代谢的要求。Ost在大鼠肝细胞体外温孵液代谢实验研究提示Ost的代谢具有酶促动力学代谢特征。CYP2D6抑制剂Yoh、CYP2C9抑制剂Sul、CYP2C8抑制剂Que不抑制Ost在大鼠肝细胞体外温孵液中的代谢。CYP3A4诱导剂Rif则明显诱导Ost的代谢;CYP3A4抑制剂Tro呈剂量依赖性抑制Ost的代谢。CYP3A4可能是介导Ost在大鼠体内代谢的CYP450酶。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 大鼠肝细胞分离与验证
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂与药品
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 溶液的配制
• 2.2.2 大鼠肝细胞的分离提取
• 2.2.3 大鼠肝细胞活力与产率
• 2.3 结果
• 2.3.1 肝细胞形态学特征
• 2.3.2 肝细胞活力和产率测定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 Ost 在大鼠原代肝细胞中的代谢研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要材料与试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 溶液配制
• 3.2.2 生物样本中 Ost 浓度测定方法的建立
• 3.2.3 不同浓度 Ost 对大鼠原代肝细胞的抑制作用
• 3.2.4 Ost 在大鼠肝细胞体外温孵液中代谢
• 3.2.5 CYP450 酶诱导剂和抑制剂对 Ost 在肝细胞温孵液中代谢的影响
• 3.2.6 CYP450 酶抑制剂醋竹桃霉素（Tro）对 Ost 代谢的抑制实验
• 3.2.7 统计方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 HPLC 方法学评价
• 3.3.2 不同浓度 Ost 对大鼠原代肝细胞的抑制作用
• 3.3.3 Ost 在大鼠肝细胞温孵液中的酶动力学
• 3.3.4 CYP450 酶的诱导剂和抑制剂对 Ost 在肝细胞温孵液中代谢的影响
• 3.3.5 CYP3A4抑制剂Tro对Ost代谢的抑制实验
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A
• 附录B 综述
• 攻读学位期间的研究成果