论文摘要
蒿甲醚（artemether）是青蒿素的甲基乙醚衍生物。青蒿素（artemisinin）是我国从传统中药黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取分离得到的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物,被世界卫生组织誉为“治疗疟疾的最大希望”。近年来,研究发现青蒿素类药物还具有抗肿瘤、抗血吸虫、免疫抑制等药理作用,其中最引人关注的是它的抗肿瘤活性。国内外学者对其抗肿瘤活性进行了大量的研究,发现青蒿素类药物对肿瘤细胞具有选择性细胞毒作用,且抑瘤谱广。作为一线抗疟药青蒿素类药物具有高效、速效、低毒、无耐药性等特点,而目前临床使用的化疗药物存在有毒副作用大、易耐药等问题,使得青蒿素类药成为理想的抗肿瘤候选药物。临床上也反馈了一些使用青蒿素类药物治疗癌症成功的病例。蒿甲醚是脂溶性药物,在水中几乎不溶。本课题旨在研究一种水包油型蒿甲醚微乳制剂,使蒿甲醚静脉给药成为可能,同时解决此类药物与其抗肿瘤增效剂—亚铁离子合用稳定性较差的问题,并且在抗肿瘤应用中能够具有一定的靶向性,为青蒿素类药物在其新适应症（抗肿瘤）中的应用提供一种合理、有效,且较易实现工业化生产的新剂型。研究的主要内容有：（1）蒿甲醚微乳的处方前研究；（2）根据蒿甲醚理化性质及微乳给药系统的特点,筛选蒿甲醚微乳的处方；（3）对蒿甲醚微乳的制剂质量进行评价；（4）考察蒿甲醚微乳在大鼠体内的药动学特点与组织分布情况,研究其体内靶向特性；（5）通过体外细胞试验评价蒿甲醚微乳的抗肿瘤活性。1.蒿甲醚微乳的处方前研究首先,建立了蒿甲醚体外含量测定方法,分析系统为Waters Acquity UPLC,采用光二极管阵列检测器（DAD）及Empower软件；色谱柱为BEH C18,1.7μm, 2.1×50mm;流动相为乙腈：水=62：38；流速：0.4 mL-min-1。检测波长210 nm,柱温40℃,进样量10μL。测定蒿甲醚在水、有机溶剂、油、乳化剂等溶媒中的溶解度,结果表明蒿甲醚在水中几乎不溶,易溶于有机溶剂。在所考察的几种油相中,蒿甲醚在油酸乙酯中溶解度最大。在所考察的乳化剂胶束溶液中,在聚氧乙烯蓖麻油乳化剂胶束溶液中溶解度最大。考察pH值与亚铁离子对蒿甲醚稳定性的影响。当pH值为2.0到12.0之问时,pH值对蒿甲醚的稳定性影响没有明显差别,可不使用缓冲溶液做溶媒。亚铁盐对蒿甲醚的稳定性有一定的影响,合用时应尽量避免二者长时间共存。2.蒿甲醚微乳的处方工艺研究通过对蒿甲醚溶解度和辅料毒性的考察,选用油酸乙酯、辛酸癸酸三甘油酯和注射用大豆油等为油相,聚氧乙烯蓖麻油、卵磷脂、吐温-80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、F-68等为乳化剂,无水乙醇为助乳化剂。采用单因素筛选,通过伪三元相图对油相、乳化剂和助乳化剂做进一步筛选。在单一乳化剂体系中,以下两个体系能够得到较大面积的微乳区域且对油的增溶能力也较好：CremophorEL35/无水乙醇/油酸乙酯/水体系、Cremorphor RH40/无水乙醇/油酸乙酯/水体系。不同亲水亲油性乳化剂共同使用作为复合乳化剂所得到的相图微乳区域面积比单一乳化剂好。其中,聚氧乙烯蓖麻油与卵磷脂合用效果最好。由于卵磷脂的应用易形成凝胶区域,用量过大至微乳的黏度较大,而聚氧乙烯蓖麻油的溶血作用使得含量不宜过高,综合考虑将聚氧乙烯蓖麻油与卵磷脂的质量比R值确定为3：1。在相图研究的基础上,采用Km值为3：1：2和3：1：4制备空白微乳,考察微乳形态、长期稳定性等指标,最终确定微乳制备条件为室温,微乳处方为油酸乙酯：Cremorphor EL35:注射用卵磷脂：无水乙醇：水=2：3：1：2：5。3.蒿甲醚微乳的制剂质量评价采用UPLC法测定蒿甲醚微乳中的药物含量,色谱柱为BEH C18,1.7μm, 2.1×50 mm;流动相为乙腈：水=40：60；流速：0.4 mL-min-1;检测波长210 nm,柱温40℃,进样量10μL。用此法测得蒿甲醚微乳最大载药量为137.72 mg-mL-1。以外观、粒径及其分布、含量、长期稳定性等为考察指标,对微乳进行质量评价。通过肉眼直接观察,空白微乳的外观为无色或略带淡黄色的澄清透明液体,蒿甲醚微乳的外观为略带淡黄色的澄清透明液体。用激光笔照射均能产生丁达尔现象,流动性较好。采用透射电镜考察其形态、粒径分布等制剂学性质,发现空白微乳与蒿甲醚微乳的乳滴均为球形,乳滴大小较均匀。空白微乳粒径大小在30-65nm,平均粒径为46nm。载药微乳粒径稍有增加,大小在28-73nm,平均粒径为47nm。考察了蒿甲醚微乳的稀释稳定性,在稀释倍数为1、10、100下,超纯水与生理盐水稀释所得稀释液均澄明,呈淡蓝色乳光,激光笔照射下丁达尔现象明显,未见药物析出。用透射电镜观察稀释后微乳样品时发现粒径有增大现象,但仍然在纳米水平。考察亚铁盐对蒿甲醚微乳稳定性的影响,将结果同亚铁离子与蒿甲醚对照品溶液共存稳定性结果进行比较。结果表明微乳能显著改善蒿甲醚的稳定性,蒿甲醚降解速率减小近四倍。但当硫酸亚铁与蒿甲醚质量比超过1：1时,蒿甲醚降解速率会显著上升,提示硫酸亚铁的使用量不宜超过蒿甲醚的用量。通过对蒿甲醚微乳的留样观察,在室温、避光的储存条件下蒿甲醚微乳未出现分层等现象,外观颜色没有变化。室温下放置4个月,蒿甲醚微乳中药物含量无显著变化。4.蒿甲醚微乳药动学和体内组织分布研究建立了蒿甲醚体内分析方法,色谱柱为BEH C18,1.7μm,2.1 x 50 mm;流动相为乙腈：水=40：60；流速：0.4 mL-min-1,检测波长210nm,柱温40℃,注入样品体积10μL。UPLC进样分析后采用3P97药动学软件对蒿甲醚微乳静脉注射后的血浆药动学参数进行估算。组织分布特征的研究方法与药动学的不同之处在于所分析的样品为各组织器官匀浆液。药动学试验结果表明蒿甲醚微乳经静脉注射给药后在大鼠体内代谢迅速。体内组织分布研究结果表明大鼠给药后2min,脑、脾脏和肝脏中即检出药物浓度,说明蒿甲醚体内转运速度相当快,并能通过血脑屏障。大鼠在给药10min后,血浆中药物浓度减半,而脾脏中药物浓度最高,其次为脑、肝脏。随着时间延长,大鼠在给药30min后,血浆中几乎检测不出药物浓度,而肾脏和脾脏中药物浓度较高,其次为肺、脑、肝脏、心脏。与蒿甲醚常规制剂在脑中含量分布最多情况不同,蒿甲醚微乳提高了药物在肝脏中的含量,改变了药物在组织中的分布情况,呈现一定的肝靶向性。5.蒿甲醚微乳体外抗肿瘤活性评价采用CCK8法测定了不同浓度的阳性对照药顺铂、蒿甲醚DMSO溶液、蒿甲醚微乳、空白微乳对肝癌细胞Hep3B的增殖抑制率,并推算当细胞生长抑制率为50%时所需药物浓度,即IC50值。结果表明蒿甲醚微乳能够提高蒿甲醚的抑瘤作用。将亚铁盐与蒿甲醚微乳按照不同比例合用,通过细胞生长抑制率的研究测定,考察亚铁盐对蒿甲醚的增效作用。结果表明蒿甲醚微乳与络合亚铁盐合用（质量比为2：1）可增强其抗肿瘤活性。结论：本论文的研究结果基本实现了预期目标,解决了肝靶向蒿甲醚抗肿瘤微乳制剂研发的技术关键问题,为其后续开发奠定了基础。通过考察蒿甲醚及其微乳与抗肿瘤增效剂亚铁盐合用的稳定性与药效学,为亚铁盐在青蒿素类药物抗肿瘤方面的合理应用作出了有意义的探索。
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相关论文文献
- [1].蒿甲醚贴剂小鼠体内药代动力学研究[J]. 中国中药杂志 2008(12)