人源细胞浆内异柠檬酸脱氢酶的结构与功能的研究

论文摘要

异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α酮戊二酸。调节异柠檬酸脱氢酶的活性对它的生物功能的发挥有关键影响。细菌源的异柠檬酸脱氢酶采用一种底物和辅酶随机结合的催化方式,并且它的活性调节是通过位于活性中心的一个绝对保守的丝氨酸的可逆磷酸化来完成的。而来源于真核生物的同工酶尽管拥有多种重要的生物功能,但它的催化方式和调节机制仍然不清楚。通过X射线晶体学的方法,我们解析出人源细胞浆内异柠檬酸脱氢酶结合底物和辅酶不同组合的晶体结构,通过对于这些结构的分析和研究,我们发现了与其生物功能相关的三种构象状态。这三种状态无论在活性中心,还是在整体分子上都有着显著的差别。一个位于活性中心的在所有已知的此类酶的结构中都呈现为α螺旋的结构单元,在开放的、非活性的构象状态下,解旋为一个长的无规卷曲;而在半张开的、中间状态的构象下,呈现为部分解旋的α螺旋;最后,在闭合的,活性状态下,又完全恢复成了α螺旋。位于这个结构单元上的279位的天冬氨酸的侧链在非活性状态下占据了底物异柠檬酸的结合位点,并且和94位的丝氨酸(相当于细菌中此酶的磷酸化位点)形成了氢键;而在活性状态下天冬氨酸的侧链是直接或间接参与金属离子鏊合的。由此我们提出了一套针对人的NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶的全新的自身调节机制。这种机制通过模仿其细菌中的同工酶的可逆磷酸化来发挥作用,并且可以很好的解释现有的生物学和生物化学数据。这些生化和结构方面的数据不仅使我们可以清楚地探讨这个酶对其底物和辅酶的结合方式以及特异性,还有助于我们了解它的催化机制和生物学意义。

论文目录

• 英文缩写
• 摘要
• ABSTRACT
• 正文
• 一、引言
• 1. 异柠檬酸脱氢酶的概况,分类
• 2. IDH 及其复合物的结构
• 2.1. 细菌来源的
• 2.2. 单体型IDH 的晶体结构
• 2.3. 真核生物IDH 的结构
• 3. IDH 的催化机制
• 4. 原核生物IDH 催化活性的调节方式
• 4.1. 磷酸化调节的结构基础
• 4.2. IDH 激酶
• 4.3. IDH 的磷酸化过程
• 4.4. 对磷酸化过程的调节
• 5. 真核生物IDH 的调节方式
• 6. 真核生物NADP-IDH 的生物学功能
• 二、材料和方法
• 1. 材料和试剂
• 1.1. 常用试剂和材料
• 1.2. 菌株
• 1.3. 酶,试剂盒
• 1.4. 仪器
• 2. 方法
• 2.1. HcIDH 基因的克隆,表达载体的构建
• 2.2. HcIDH 的表达和纯化
• 2.3. 溶液中蛋白质分子尺寸,和聚集状态分析
• 2.4. 蛋白质的鉴定及分子量测定
• 2.5. 蛋白质浓度测定方法
• 2.6. 晶体生长--悬滴气相扩散法
• 2.7. X-射线晶体衍射和数据收集
• 2.8. HcIDH 复合物的晶体结构测定
• 2.9. HcIDH 野生型酶活力的测定
• 三、结果
• 1. HcIDH 野生型的表达和纯化
• 2. HcIDH 各种复合物的晶体生长及结构解析
• 2.1. HcIDH-NADP 复合物(binary comple
• 2+复合物（quaternary complex）'>2.2. HcIDH-NADP-isocitrate-Ca²⁺复合物（quaternary complex）
• 3. HcIDH 的整体结构
• 3.1. 结构域的划分
• 3.2. 功能口袋
• 3.3. 钩扣结构域
• 4. HcIDH 二聚体的形成
• 5. 底物和金属离子的结合位点及方式
• 5.1. 底物的结合位点
• 5.2. 金属离子的结合位点
• 6. 辅酶的结合位点
• 6.1. binary complex 中的辅酶结
• 6.2. quaternary complex 中的辅酶结
• 7. 不同结构中的构象差异
• 四、讨论
• 1. 辅酶的特异性识别
• 314的功能分析'>2. Arg³¹⁴的功能分析
• 3. 不同的构象可能代表生物学相关的酶的不同状态
• 4. HcIDH 的催化机制
• 5. HcIDH 的自身调节机制
• 6. 自身调节的生物学意义
• 五、结论
• 六、参考文献
• 附录
• 发表文章目录
• 获奖
• 致谢