论文摘要
背景和目的DNA聚合酶β（DNA polymeraseβ，polβ）是DNA聚合酶家族中的一员，为一看家基因，从酵母到哺乳类细胞均高度保守，广泛分布于哺乳动物细胞内。它是目前已知碱基切除修复（base excision repair，BER）中最重要的聚合酶之一。其主要功能被认为是参与DNA修复，在碱基切除修复过程中主要填补1-4个核苷酸缺口。但其在碱基掺入过程中有着很高的错误率，是哺乳动物体内最不精确的一种DNA聚合酶，通常情况下在体内恒定的低水平表达。DNA polβ的表达则与细胞周期无关，在许多细胞内、外刺激因素，如DNA损伤剂的处理都可以诱导其表达，polβ的表达绝对或相对升高，将干扰或取代细胞内其他聚合酶的正常功能。近年来许多学者认为细胞DNA损伤与肿瘤的发生有密切关系，polβ作为一重要的DNA修复酶，其突变与一些肿瘤的发生有关。现已在人类肿瘤组织标本中如直肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌中发现DNA polβ的高表达，且有多种形式的碱基突变，而且在产生化疗药物耐药的肿瘤细胞中发现polβ的表达也是增高的，表明polβ的增高可能在肿瘤的发生发展以及耐药性的产生中起着一定作用。本课题组先前的研究已经发现胃癌组织和细胞系中DNA polβ基因的mRNA和蛋白表达水平显著高于正常胃组织。DNA polβ高表达介导过多的DNA低保真复制合成并由此导致基因组的不稳定性增加和细胞的自发突变率升高，可能是介导肿瘤发生及肿瘤化疗中一些抗癌药物耐受产生的重要分子机制。因此，寻求有效干预DNA polβ过表达并使其呈现适宜水平表达的线索和途径对于肿瘤的有效干预防治具有重要理论和实用意义。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA引发的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）现象。该技术能够有效使转录后基因沉默，甚至可以代替基因敲除，是目前研究基因调控的重要手段。本研究构建polβ基因靶向的siRNA表达载体，转染到胃癌细胞株BGC-823中，检测该细胞中polβ基因表达的沉默效果，同时初步观察polβ基因表达抑制后对细胞生物学行为的影响。实验方法利用Takara、Ambion和Promega siRNA靶序列分析设计系统，扫描人polβcDNA编码序列（M13140），依据siRNA靶序列设计原则，经BLAST同源性分析，选择确定19个碱基的siRNA靶序列。分别合成2对靶向polβsiRNA序列和一对无关siRNA的DNA单链，退火成双链DNA，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切siRNA表达载体pRNAT-U6.1；将具有相同酶切位点的发卡样siRNA片段克隆入siRNA表达载体pRNAT-U6.1中；利用PCR扩增法筛选鉴定重组子pRNAT-U6.1-sipolβ1、pRNAT-U6.1-sipolβ2、pRNAT-U6.1-Con；对插入序列进行DNA序列分析。将siRNA表达载体pRNAT-U6.1-sipolβ1、pRNAT-U6.1-sipolβ2、pRNAT-U6.1-Con转入人胃癌细胞系BGC-823中，同时设空载体对照组（转染空载体pRNAT-U6.1）和空白对照组（未转染）；用荧光定量PCR方法检测各组细胞polβmRNA表达水平；用流式细胞术检测各组细胞周期及细胞增殖率，并将各组的细胞注射裸鼠皮下组织以观察肿瘤细胞体内的增殖情况，最后用荧光定量PCR检测各组肿瘤组织中polβmRNA表达水平。实验结果1．初步筛选得到27个后选片段，对这些候选序列通过同源序列检索和进一步优选，最终确定5’274-292位（GAACGTGAGCCAAGCTATC）和661-679位（GATTCGGCAGGATGATACG）为siRNA靶序列，并选择一无关对照的发卡样DNA序列。2．siRNA发卡DNA的退火后三个退火产物sipolβ1、sipolβ2和Con，电泳可见三条明亮条带，位于约70bp处，与设计完全一致。3．成功构建重组子pRNAT-U6.1-sipolβ1、pRNAT-U6.1-sipolβ2和pRNAT-U6.1-Con，测序分析其序列与设计完全一致。4．转染48小时后用荧光显微镜观察胃癌细胞可看见大量GFP表达，经G418筛选转染细胞得到对其有抗性的细胞。5．转染polβ靶向siRNA（pRNAT-U6.1-sipolβ1，pRNAT-U6.1-sipolβ2）的BGC-823细胞，DNA聚合酶β基因的mRNA表达水平明显降低，pRNAT-U6.1-sipolβ2的沉默抑制作用强于pRNAT-U6.1-sipolβ1，几近完全抑制。转染无关siRNA（pRNAT-U6.1-Con）BGC-823细胞，polβmRNA表达水平不降低。6．无关siRNA对照组、空载体对照组、空白对照组之间G0～G1期、G2～M期、S期比例及细胞增殖率的差异无显著性（P＞0.05）；与未转染的BGC-823细胞、转染空载体pRNAT-U6.1及转染无关siRNA（pRNAT-U6.1-Con）的BGC-823细胞相比，转染pRNAT-U6.1-sipolβ1的细胞呈现部分抑制，其S期比例明显降低，对应的细胞增殖率亦显著下降，统计学处理均有显著性差异（P＜0.05）。而转染pRNAT-U6.1-sipolβ2的细胞polβ表达几乎完全抑制，其S期比例则反而显著增加，细胞增殖率亦显著升高。7．实验组与对照组细胞分别注射裸鼠皮下组织，结果显示呈现部分抑制作用的实验组1裸鼠肿瘤的生长速度、大小及重量均低于对照组及实验组2（P＜0.01），而呈现几乎完全抑制作用的实验组2裸鼠肿瘤的生长速度、大小及重量均高于其它组（P＜0.05）。其各组肿瘤组织中polβmRNA表达水平结果与各组细胞中的结果一致。结论1．成功构建出针对polβ的siRNA表达载体pRNAT-U6.1-sipolβ1、pRNAT-U6.1-sipolβ2和无关siRNA表达载体pRNAT-U6.1-Con；靶向siRNA表达载体转染胃癌细胞后能显著降低细胞polβmRNA表达。2．polβ的高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态；BGC-823细胞中polβ表达，通过siRNA沉默到合适的低水平，对肿瘤的生长可以起到抑制作用。