FAD2基因RNAi及其对脂肪酸组成的影响

论文摘要

油菜作为一种重要的油料作物，在我国每年生产的食用油中，约占40％左右。油酸是菜籽油的优质成分，提高油菜品质是油菜育种的目标之一。油酸不仅在食用方面具有氧化稳定性，可长期保存的特点，高油酸植物油在工业上也有很高的利用价值。因此，提高油酸含量已成为油菜品质改良的重点。基因工程技术已经逐渐成为作物种质改良中主要的手段之一。本研究采用RNAi技术，构建具有种子特异性表达的含fad2反向重复序列的ihpRNA表达载体，通过农杆菌介导法和花粉管通道法转化甘蓝型油菜。本研究旨在通过RNAi技术抑制fad2基因在种子发育期的表达，达到降低油菜籽中亚油酸和a亚麻酸的合成，提高油酸含量的目的。主要研究结果如下：1．根据GeneBank序列AF420598设计引物，在甘蓝型油菜中PCR克隆Napin启动子，插入ihpRNA中间载体pKANNIBAL中取代原35S启动子，构建具有种子特异性表达启动子的ihpRNA中间载体pKA-N；根据GeneBank中序列AF243045设计引物，通过RT-PCR在甘蓝型油菜中克隆fad2基因，通过比对选取约310bp保守区段，反向重复插入ihpRNA中间载体pKA-N中，构建好完整的ihpRNA中间载体pKA-N-fad2。将中间载体中表达区段插入最终表达载体pGreen0229中，构建好最终ihpRNA表达载体pG-fad2i。2．构建原核表达载体PET-fad2，对克隆的fad2基因编码区进行原核表达，SDS-PAGE检测，得到与预测结果一致的融合蛋白。3．通过农杆菌介导法和花粉管通道法转化甘蓝型油菜中双9号，61077，61078。经除草剂筛选获得抗除草剂植株30株。其中获得10株双9号，16株61077，4株61078。4．PCR检测表明转基因植株假阳性率为50％左右。5．对转基因植株的种子进行分析，分析脂肪酸组成变化：甘蓝型油菜中双9号油酸含量平均提高约7％，亚油酸含量平均降低约6％，亚麻酸含量平均降低约1％；甘蓝型油菜61077油酸含量平均提高约4％，亚油酸含量平均降低约3％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 RNAi技术的研究进展
• 1.1.1 RNAi的作用机制
• 1.1.2 RNAi的特点
• 1.1.3 RNAi技术在植物中的应用
• 1.2 基因工程与油菜改良的研究进展
• 1.2.1 基因工程技术与油菜种子脂肪酸改良
• 1.2.2 基因工程技术与抗虫、抗病、抗除草剂油菜品种选育
• 1.3 转基因与雄性不育
• 1.4 研究的目的及意义
• 第二章 甘蓝型油菜FAD2基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物总RNA的抽提
• 2.2.2 反转录cDNA第一链
• 2.2.3 目的基因的PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物的回收
• 2.2.5 PCR产物3'端加尾
• 2.2.6 PCR产物与测序载体的连接
• 2.2.7 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.8 连接产物转化感受态细胞
• 2.3 结果与分析
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 甘蓝型油菜FAD2基因的原核表达
• 3.1 原核表达载体的构建
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 FAD2基因在BL21（DE3）中的表达
• 3.2.1 杂种蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.2.2 试剂配制及制胶
• 3.2.3 样品处理
• 3.2.4 电泳
• 3.2.5 染色与脱色
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 原核表达载体的构建
• 3.3.2 FAD2基因在BL21（DE3）中的诱导表达
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 FAD2基因ihpRNA载体在油菜中的转化
• 4.1 FAD2ihpRNAi表达载体构建
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 FAD2基因ihpRNA载体在油菜中的转化
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 转基因油菜的分子生物学鉴定
• 4.3.1 材料
• 4.3.2 方法
• 4.4 转基因油菜种子脂肪酸检测
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 FAD2ihpRNAi表达载体构建
• 4.5.2 甘蓝型油菜的转化与抗bar转基因苗的获得
• 4.5.3 转基因油菜PCR检测
• 4.5.4 转基因油菜种子脂肪酸检测
• 4.6 小结与讨论
• 4.6.1 Napin启动子的克隆
• 4.6.2 甘蓝型油菜的转化
• 4.6.3 转基因油菜种子脂肪酸检测
• 第五章 讨论与总结
• 5.1 讨论
• 5.1.1 RNAi技术的应用
• 5.1.2 脂肪酸的合成调控
• 5.1.3 油菜的遗传转化
• 5.2 小结
• 参考文献
• 致谢