湖南省黄鳝体内胃瘤线虫感染调查及遗传特异性研究

论文摘要

黄鳝寄生虫病是危害黄鳝健康的一大类疾病。黄鳝中寄生线虫种类很多,胃瘤线虫幼虫为优势虫种,感染后不仅影响其生长发育,还使其更容易遭受其它病原的入侵,继发多种疾病,严重时甚至造成黄鳝的死亡。本研究的第一部分首次对湖南省17个采样点共计928尾养殖类和野生类黄鳝体内胃瘤线虫感染情况进行了调查,结果表明岳阳采样点的野生类黄鳝胃瘤线虫的感染率最高（44.44%）；马王堆采样点的养殖类黄鳝胃瘤线虫的感染率最低（4.46%）。湘潭采样点的野生类黄鳝胃瘤线虫的感染强度最大（6.20条/尾）；永州采样点的野生类黄鳝胃瘤线虫的感染强度最小（1.00条/尾）。总体就两类样本而言,养殖类黄鳝的感染率为22.29%,感染强度为1.84条/尾；野生类黄鳝的感染率为22.34%,感染强度为1.97条/尾。该调查结果为更好地防治黄鳝胃瘤线虫病提供了重要的依据。本研究的第二部分分析了黄鳝胃瘤线虫线粒体细胞色素C氧化酶第一亚基（coxl）的基因片段。根据GenBankTM上已发表的胃瘤线虫相关基因序列设计一对引物,对coxl基因进行扩增、转化及测序。将得到的17条coxl基因部分序列片段（pcox1）经过互对比较及分析,结果显示pcox1序列片段无长度差异、碱基变异率为10.7463%、种内差异为0-5.3%；碱基C含量最高,为（29.99±0.6343）%、碱基G含量最低,为（17.03±0.2468）%。此外,通过系统发生树分析发现coxl基因序列能将胃瘤线虫及其他无尾感器纲线虫很好的区分开来,且采集的17个样品中很可能存在多个基因型。由此表明,coxl基因的保守性非常高,可以选择coxl作为遗传标记进行胃瘤线虫的分类鉴定。本研究的第三部分分析了黄鳝胃瘤线虫核糖体DNA（rRNA）内部转录间隔区（ITS）的序列。根据GenBankTM上已发表的胃瘤线虫相关基因序列设计一对引物,对ITS序列进行扩增、转化及测序。分析发现获得的黄鳝胃瘤线虫ITS-1基因片段长度存在一定差异,为350-351bp; G+C含量为（44.39±0.5541）%；种内差异为0-7.2%；ITS-2基因片段长度亦存在一定差异,为340-344bp; G+C含量为（45.90±0.3971）%；种内差异为0-5.2%。通过对ITS全序列进行系统发生树的构建发现,湖南省采集的样品株与NCBI上搜索到的3株样品能明显的分为三大枝,且其能准确的与其他无尾感器纲线虫区分开来。而湖南省采集的样品均分布在其中的两大枝上。由此表明, ITS序列同样适合做为遗传标记对胃瘤线虫进行分类鉴定,且相比于cox1基因更为合适。本试验系国内首次针对湖南省多地黄鳝胃瘤线虫cox1、ITS序列进行遗传变异情况分析,找到了有效的遗传标记用以研究胃瘤线虫分子分类学、种群遗传学,并发现了黄鳝体内胃瘤线虫幼虫至少存在两种基因型,补充了国内黄鳝体内胃瘤线虫分子水平相关研究的空白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 黄鳝养殖的重要性
• 1.1 黄鳝的分布
• 1.2 黄鳝的营养价值
• 1.3 黄鳝的药用价值
• 1.4 黄鳝的开发利用价值
• 1.5 黄鳝的自然资源现状及养殖前景
• 2 黄鳝的寄生虫病
• 2.1 寄生虫的种类
• 2.2 寄生虫对黄鳝的危害
• 3 黄鳝中寄生虫的研究概况
• 3.1 国内关于黄鳝中寄生虫的研究概况
• 3.1.1 棘头虫
• 3.1.2 鳗鲡独孤吸虫
• 3.1.3 胃瘤线虫
• 3.1.4 鳝锥体虫
• 3.1.5 黄鳝寄生虫的感染情况调查
• 3.2 国外关于黄鳝中寄生虫的研究概况
• 4 胃瘤线虫研究概况
• 4.1 国内关于胃瘤线虫的研究概况
• 4.2 国外关于胃瘤线虫的研究概况
• 4.2.1 胃瘤线虫的种类
• 4.2.2 胃瘤线虫的生活史
• 4.2.3 胃瘤线虫种间的感染差异
• 4.2.4 胃瘤线虫的分布
• 4.2.5 胃瘤线虫感染的季节性
• 4.2.6 胃瘤线虫的形态学
• 5 DNA序列在分类鉴定和系统发育中的应用
• 5.1 核糖体DNA序列
• 5.2 线粒体DNA序列
• 6 研究内容与目的意义
• 6.1 研究内容
• 6.2 目的意义
• 第二章 湖南省黄鳝胃瘤线虫感染情况调查
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样品来源
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 器材
• 1.2 方法
• 1.2.1 虫体采集
• 1.2.2 虫种鉴定
• 1.2.3 判定依据
• 2 试验结果
• 2.1 虫种鉴定
• 2.1.1 头部显微观察
• 2.1.2 尾部显微观察
• 2.2 湖南省黄鳝胃瘤线虫感染情况
• 3 讨论
• 第三章 黄鳝寄生的胃瘤线虫线粒体cox1基因多态性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 虫体样品
• 1.1.2 仪器和试剂
• 1.1.2.1 主要仪器
• 1.1.2.2 试剂和酶
• 1.1.3 溶液和培养基的配制
• 1.1.3.1 溶液的配制
• 1.1.3.2 培养基的配制
• 1.1.3.3 感受态细胞的制备
• 1.2 方法
• 1.2.1 虫体总DNA的提取
• 1.2.1.1 虫体的处理
• 1.2.1.2 虫体DNA的提取
• 1.2.2 线粒体DNA cox1基因片段的PCR扩增
• 1.2.2.1 cox1基因片段的PCR扩增
• 1.2.2.2 PCR产物的纯化和连接
• 1.2.2.3 重组质粒转化及菌落PCR鉴定
• 1.2.3 DNA测序及分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增结果
• 2.2 DNA测序结果
• 2.3 DNA序列分析结果
• 2.3.1 pcox1基因序列BLAST比对
• 2.3.2 pcox1基因序列碱基含量
• 2.3.3 pcox1基因序列种内相似性与差异性
• 2.3.4 pcox1基因序列系统发生树
• 3 讨论
• 第四章 黄鳝寄生的胃瘤线虫rDNA ITS基因的扩增及多态性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 虫体样品
• 1.1.2 仪器和试剂
• 1.1.3 溶液和培养基的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 虫体总DNA的提取
• 1.2.2 核糖体DNA ITS片段的PCR扩增
• 1.2.2.1 ITS片段的PCR扩增
• 1.2.2.2 PCR产物的纯化和连接
• 1.2.2.3 重组质粒转化及菌落PCR鉴定
• 1.2.3 DNA序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增结果
• 2.2 DNA测序结果
• 2.3 DNA序列分析结果
• 2.3.1 ITS基因序列BLAST比对
• 2.3.2 ITS基因序列碱基含量
• 2.3.3 ITS基因序列种内相似性与差异性
• 2.3.4 ITS基因序列系统发生树
• 3 讨论
• 第五章 结论与创新
• 1 结论
• 2 创新
• 参考文献
• 本论文常用英文缩写
• 致谢
• 作者简介
• 附图一：脊椎动物mtDNA结构示意图
• 附图二：胃瘤线虫pcox1序列比对结果
• 附图三：核糖体DNA重复序列
• 附图四：胃瘤线虫ITS-1序列比对结果
• 附图五：胃瘤线虫ITS-2序列比对结果