纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）产纳他霉素高产菌株的选育

论文摘要

纳他霉素（Natamycin）为二十六元多烯大环内酯类抗生素,一种高效、广谱、安全的抗真菌生物食品防腐剂,主要由纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）、恰塔努加链霉菌（Streptomyces chatanoogensis）和褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）等产生菌经发酵过程产生。为了提高纳他霉素的产量,本论文对纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）HDMNTE-01的培养方式、发酵液中纳他霉素的检测方法及纳他霉素高产菌株的选育进行了系统的研究。首先对管碟法测定发酵液中纳他霉素的各项参数进行了研究。结果表明,将检测菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W23培养至107CFU/mL,以10%的量加入到上层培养基中制备双层检测平板,在牛津杯中加入70μL经甲醇提取的检测液,培养24h后观察结果所得数据符合要求。比较6种不同的斜面培养基和4种不同的种子培养基,选择出培养和保藏HDMNTE-01的最佳培养基配方。孢子斜面培养基（g/L）:葡萄糖10、淀粉10、黄豆饼粉10、麦芽抽提物3、酵母抽提物3、MgSO4·7H2O 1、K2HPO4 0.5、NaCl 2、CaCO3 3、琼脂20;种子培养基配方（g/L）:淀粉10、黄豆饼粉10、蛋白胨6、玉米浆6、葡萄糖10、MgSO4·7H2O 1、K2HPO4 0.5、NaCl 2、CaCO3 5。研究了HDMNTE-01摇瓶发酵的种龄、接种量、装液量、发酵培养基初始pH、温度、转数等对发酵的影响,得到最佳发酵条件为:接种量6%、装液量为25mL/50mL,发酵液初始pH值为7.0,发酵96h为代谢产物最佳收获时间;摇床温度为28℃;转数为220r/min。根据纳他霉素的生物合成途径和代谢调节机理,对纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌HDMNTE-01进行诱变,选育高产菌株。以琼脂块法筛选到的103号菌为出发菌株,先后分别经紫外线、DES、吖啶橙、紫外线+氯化锂复合诱变后,共筛选乙酸钠、丙酸钠、硫酸链霉素抗性突变株共441株,采用琼脂块法分离纯化后,经发酵液纳他霉素含量测定,最终获得高产突变株F-99,其摇瓶发酵效价达1.78g/L,比出发菌株提高302%。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 纳他霉素的概述
• 1.1.1 发现与命名
• 1.1.2 理化性质
• 1.1.3 纳他霉素的抑菌作用
• 1.1.3.1 抑菌机理
• 1.1.3.2 抑菌谱
• 1.1.3.3 纳他霉素作为防腐剂的特点
• 1.1.4 纳他霉素的应用
• 1.1.4.1 食品中的应用
• 1.1.4.2 医疗中的应用
• 1.1.4.3 在青贮饲料方面的应用
• 1.1.5 纳他霉素的检测方法
• 1.1.5.1 生物检测法
• 1.1.5.2 高效液相色谱（HPLC）法
• 1.1.5.3 紫外分光光度法
• 1.1.5.4 元素分析法
• 1.1.5.5 比色分析法
• 1.2 纳他霉素的生产概述
• 1.2.1 纳他霉素产生菌
• 1.2.2 纳他霉素的分离提取
• 1.3 抗生素产生菌的诱变育种的研究概况
• 1.3.1 诱变方法
• 1.3.1.1 诱变育种
• 1.3.1.2 遗传重组育种
• 1.3.1.3 基因工程育种
• 1.3.2 突变株的筛选
• 1.3.2.1 随机筛选
• 1.3.2.2 耐碳源分解代谢物阻遏突变株的筛选
• 1.3.2.3 耐前体及其结构类似物突变株的筛选
• 1.3.2.4 链霉素抗性突变株的筛选
• 1.3.2.5 琼脂块法初筛纯化出发菌株
• 1.3.3 诱变剂量的选择
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.4.1 本研究的目的
• 1.4.2 试验研究的意义:
• 1.4.3 试验的技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 溶液配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌株的活化和培养
• 2.2.1.1 菌种活化与保藏
• 2.2.1.2 孢子悬浮液的制备与孢子计数
• 2.2.1.3 斜面培养
• 2.2.1.4 单菌落分离平板培养
• 2.2.1.5 种子液培养
• 2.2.1.6 发酵培养及发酵液的提取
• 2.2.2 纳他霉素生物检测方法
• 2.2.2.1 敏感菌液制备
• 2.2.2.2 纳塔尔链霉菌发酵液的制备
• 2.2.2.3 双层检测平板的制备
• 2.2.2.4 敏感菌的筛选
• 2.2.2.5 敏感菌浓度的确定
• 2.2.2.6 一剂量管碟法绘制纳塔霉素标准曲线
• 2.2.2.7 发酵液中纳他霉素提取溶剂对提取效果的影响
• 2.2.2.8 琼脂块法筛选菌株
• 2.2.2.9 生产菌生物量（DCW）的测定
• 2.2.3 菌株培养方法的优化
• 2.2.3.1 斜面孢子培养基和培养时间的确定
• 2.2.3.2 种子培养液和培养时间的确定
• 2.2.3.3 最佳接种量的确定
• 2.2.3.4 摇床发酵转数的确定
• 2.2.3.5 摇床发酵温度的确定
• 2.2.3.6 溶解氧对那他霉素产量的影响
• 2.2.3.7 发酵培养基初始pH 值对发酵的影响
• 2.2.3.8 菌株生长曲线和纳他霉素积累曲线
• 2.2.4 诱变
• 2.2.4.1 筛选剂最小抑菌浓度（MIC）的确定
• 2.2.4.2 诱变致死率的测定
• 2.2.4.3 诱变正突变率的的计算
• 2.2.4.4 诱变贡献率计算
• 2.2.4.5 诱变方法
• 第3章 结果与分析
• 3.1 纳他霉素检测方法的确定
• 3.1.1 敏感菌的筛选
• 3.1.2 敏感菌浓度的确定
• 3.1.3 发酵液中纳他霉素提取剂的确定
• 3.1.4 标准曲线的绘制
• 3.2 纳塔尔链霉菌产纳他霉素培养方式的确立
• 3.2.1 斜面孢子培养基和培养时间的确定
• 3.2.2 种子液培养基和培养时间的确
• 3.2.3 最佳接种量的确定
• 3.2.4 摇床发酵转数的确定
• 3.2.5 摇床发酵温度的确定
• 3.2.6 溶解氧对纳他霉素产量的影响
• 3.2.7 发酵培养基初始pH 值对发酵的影响
• 3.2.8 菌株生长曲线和纳他霉素积累曲线
• 3.3 纳他霉素产生菌的诱变育种
• 3.3.1 出发菌株的选择
• 3.3.2 最小抑菌浓度的确定
• 3.3.3 紫外线诱变选育纳他霉素生产菌
• 3.3.3.1 紫外线诱变剂量的选择
• 3.3.3.2 紫外线诱变菌株的筛选结果
• 3.3.4 硫酸二已酯（DES）诱变选育纳他霉素生产菌
• 3.3.3.1 DES 诱变剂量的选择
• 3.3.4.2 DES 诱变筛选结果
• 3.3.5 吖啶橙诱变选育纳他霉素生产菌
• 3.3.5.1 吖啶橙诱变剂量的选择
• 3.3.5.2 吖啶橙诱变筛选结果
• 3.3.6 紫外线+氯化锂诱变选育纳他霉素生产菌
• 3.3.6.1 紫外线+氯化锂诱变剂量的确定
• 3.3.6.2 紫外线+氯化锂诱变的筛选结果
• 3.3.7 高产突变株 F-99 的遗传稳定性及与原始菌株抑菌圈对比
• 3.3.8 各种诱变因子诱变后菌落形态的变异
• 3.3.9 抗性筛选剂的比较
• 第4章 讨论
• 4.1 检测方法
• 4.2 培养方法
• 4.3 诱变育种
• 4.3.1 诱变结果
• 4.3.2 四种诱变方法效果的比较
• 4.3.3 诱变顺序和诱变方法的差异可能导致诱变结果的不同
• 4.4 展望
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间所发表的论文