论文摘要
日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）属于黄病毒科黄病毒属,是有囊膜的正链RNA病毒,主要的囊膜糖蛋白E与病毒的神经毒性和神经侵袭性相关,能够诱导机体产生保护性免疫反应。作为JEV的病毒吸附蛋白（virus attachment protein,VAP）,E蛋白介导JEV与宿主细胞受体结合及膜融合。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。JEV引起的流行性乙型脑炎（乙脑）,是一种严重的急性中枢神经系统传染病,主要流行于我国广大地区及东亚、东南亚和南亚。JEV致病机制尚未完全阐明。人被携带JEV的蚊子叮咬后,病毒先在淋巴细胞、骨髓细胞及血管内皮细胞增殖。在侵袭中枢神经系统前,有一个短暂的病毒血症期。JEV和脑血管内皮细胞及其周围细胞的细胞膜相互作用后,通过受体介导的内吞,JEV与胞浆囊泡膜融合形成内化囊泡,再被转运穿过血脑屏障。在颅内,JEV仅在神经元中复制。神经元和胶质细胞大量表达巨噬细胞移动抑制因子（MIF）,介导广谱的免疫炎症反应。JEV的感染也诱导神经元的凋亡。目的:病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节,也是影响病毒宿主特异性、组织亲嗜性和致病性的决定因素之一。目前,JEV在易感细胞上的受体分子及其特性与功能仍然不清楚。为了鉴定JEV的受体,本研究从以下两种思路出发,分别进行了JEV受体候选分子的初步研究。方法和结果:一、筛选建立JEV受体功能缺陷的细胞系,并鉴定其功能。应用ICR-191（一种DNA烷化剂,通过DNA小片段缺失和移码突变使细胞随机突变）诱变JEV易感细胞——地鼠肾细胞BHK-21。经过JEV攻击、克隆化和RT-PCR筛选,获得了一株突变细胞系3A10-3F,并鉴定其为JEV受体功能缺陷。1.间接免疫荧光实验:JEV感染的3A10-3F细胞的荧光强度明显弱于JEV感染的BHK-21细胞,说明3A10-3F细胞对JEV的感染有相当的抵抗。2.空斑实验: MOI 1和MOI 10的JEV感染后,3A10-3F细胞比BHK细胞上清中JEV最高滴度分别降低了2个数量级和1个数量级,进一步证实3A10-3F细胞的确对JEV的敏感性降低了许多。3.流式细胞术: 3A10-3F细胞与JEV的结合率仅有2.10 % ,而BHK-21细胞与JEV的结合率可达48.84 %。3A10-3F细胞对JEV的结合率明显降低,进一步说明3A10-3F细胞为JEV受体功能缺陷。4.对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的易感性:在形态上,3A10-3F细胞与BHK-21细胞相似,仍然保留着对HSV-1的易感性。HSV-1感染后,与BHK-21一样出现细胞病变:细胞融合,变圆及融合。所以这株突变细胞系对JEV感染的抵抗是特异的。5.为了鉴定突变细胞3A10-3F与亲代细胞BHK-21膜分子的表达差异,应用了蛋白质组学的方法,即二维电泳（2-DE）组合液质联用质谱（LC-MS/MS）技术,首次鉴定了3A10-3F细胞上有明显差异表达的四种膜蛋白,即钙结合蛋白annexin 1, annexin 2;电压依赖的离子通道（VDAC）蛋白VDAC 1, VDAC 2。6. 3A10-3F细胞上annexin 1, annexin 2的表达明显下降。这两个分子有可能通过与脂膜的相互作用与JEV的结合相关,它们在3A10-3F细胞上表达的下调,导致JEV与3A10-3F细胞膜的结合能力明显下降。7. VDAC 1仅仅表达在3A10-3F细胞上,VDAC 2在3A10-3F细胞上的表达升高。这两个VDAC分子可能在JEV穿入3A10-3F细胞过程中起着离子通道的作用,同时也参与其它包括信号转导的细胞功能。二、从易感细胞上分离JEV受体候选分子,并初步鉴定其功能。1.应用免疫共沉淀方法（Co-immunoprecipitation, Co-IP）,从白纹伊蚊细胞C6/36、非洲绿猴肾细胞Vero及BHK-21细胞膜上,分离到多个与JEV结合的分子条带。2.质谱分析首次鉴定出一个蛋白,即C6/36细胞上与JEV结合的74 kD分子为HSC70蛋白。3.免疫印记实验中,用抗HSC70抗体检测到从C6/36细胞膜上免疫共沉淀分离到的74 kD蛋白。4.将主要的JEV受体候选分子,即C6/36细胞膜上免疫共沉淀分离到的74 kD、97 kD分子电洗脱下来后,分别免疫小鼠制备抗体,进行病毒结合的阻断实验。结果显示,抗74 kD、97 kD抗体及抗HSC70抗体均以剂量依赖的方式部分阻断JEV与C6/36细胞的结合。在JEV MOI 100,抗体浓度为200μg时,抗97kD、74 kD抗体和抗HSC70抗体分别使JEV的结合率下降38%、35%、20%。5.间接免疫荧光实验:激光共聚焦显微镜观察到74 kD、97 kD及HSC70分子定位在C6/36细胞膜上。免疫荧光双标记实验结果显示JEV与74 kD、97 kD及HSC70分子共定位在C6/36细胞膜上。这些结果说明74 kD、97 kD及HSC70分子参与JEV吸附到C6/36细胞膜上。结论:1.突变细胞系3A10-3F可能是缺乏结合受体的功能,而辅受体仍然能够介导JEV进入细胞内。2. C6/36细胞上74 kD、97 kD分子可能是JEV受体的复合物组分,而74 kD分子可能是HSC70。综上所述,这些研究结果将为深入研究JEV受体特性与功能,阐明JEV致病机制提供有益的线索。