奶山羊Th17细胞主要效应分子的克隆表达

论文摘要

乳房炎是造成奶业损失最严重的疾病之一,尽管对乳房炎的研究已进行了相当长的间,但至今仍没有良好的解决养殖场乳房炎的办法。引起乳房炎的病原体有150多种,但主要是由胞外菌感染引起。最近研究发现,CD4+T细胞的新亚群Th17细胞在一些胞外菌感染中发挥重要作用,Th17细胞受刺激活化后,分泌细胞因子（IL-17、IL-22和IL-21）诱导靶细胞分泌炎症介质和抗微生物肽,诱导局部中性粒细胞聚集,抵抗微生物入侵。牛羊乳房炎的特征是乳汁中中性粒细胞数上升,因此,我们推测Th17细胞通过分泌细胞因子IL-17、IL-22和IL-21在乳房炎生中发挥着重要作用。为了研究Th17细胞因子在奶山羊乳房炎中的作用,本实验根据奶牛Th17细胞因子IL-17、IL-22和IL-21核酸序列,设计引物,从ConA活化的奶山羊外周血单个核细胞（PBMCs）中提取总RNA,RT-PCR法扩增目的序列,对获得的核酸序列进行序列分析后设计ORF区引物,进行原核和真核表达,获得的原核表达产物制备多抗,获得的真核表达产物刺激奶山羊乳腺上皮细胞（caMECs）,MTT法检测其增殖情况。获得以下研究结果:1. RT-PCR法从丝裂原活化的PBMCs提取的总RNA中扩增出的奶山羊IL-17（CaIL-17）、CaIL-22和CaIL-21 DNA片段大小分别为1012bp、1111bp和407bp。序列分析结果表明,获得的CaIL-17含有462bp的开放阅读框（ORF）编码153个氨基酸（aa）,分子量为17.2 ku,ORF区含有23aa的N-端信号肽,6个保守的组氨酸残基,CaIL-17氨基酸序列与牛、猪、人和小鼠IL-17蛋白的相似性分别为97.39%、82.35%、73.55%和65.82%;获得的CaIL-22序列含有570bp的ORF区,推导的IL-22前体含有190aa,分子量为21.4 ku,含有33aa的信号肽,3个潜在的糖基化位点,4个保守半胱氨酸残基,CaIL-22氨基酸序列与牛、猪、人和小鼠IL-22蛋白的相似性分别为88.95%、66.84%、64.74%和56.32%;获得的CaIL-21为部分编码区,编码130aa,分子量为15.1 ku,含有4个保守半胱氨酸残基,CaIL-21与牛、猪、人和小鼠IL-21的序列同源性分别为82.89%、75.00%、66.05%和58.90%。2.将CaIL-17和CaIL-22成熟肽区连接到原核表达载体pET-32a上,在E. coli BL21（DE3）中进行表达,对诱导表达条件进行优化发现pET32a-CaIL-17在30℃,5h时表达效果最好,pET32a-CaIL-22在37℃,5h时表达效果最好,IPTG浓度对表达量影响不显著,表达的蛋白以包涵体的形式存在,包涵体经洗涤、变性和复性后获得的蛋白纯度在90%以上,纯化蛋白免疫家兔制备多抗,ELISA检测其效价在1:200 000以上。3.构建重组穿梭载体Bacmid-CaIL-17、Bacmid-CaIL-21和Bacmid-CaIL-22,转染Sf9昆虫细胞,检测结果显示重组蛋白主要存在于上清中,用含有重组CaIL-17（rCaIL-17）、rCaIL-21和rCaIL-22的上清单独或联合刺激原代培养caMECs,MTT法检测结果显示,rCaIL-17刺激组与对照组相比有显著性差异（P=0.0197）,其余组与对照组相比有极显著差异（P﹤0.01）,联合刺激组SI值高于单独刺激组,三种蛋白共同刺激效果最好,SI值为1.960±0.095。以上结果表明,本实验成功克隆了Th17细胞因子IL-17、IL-21和IL-22,获得的真核重组蛋白具有生物学活性,同时Th17细胞因子可以促进MECs增殖,细胞因子间存在协同促进作用。获得的奶山羊IL-17、IL-21和IL-22基因序列和生物学活性重组蛋白有助于阐明Th17细胞因子在乳房炎中的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 第一章 Th17 细胞和乳腺免疫研究进展
• 1.1 Th17 细胞的发生与分化
• 1.1.1 Th17 细胞的发现
• 1.1.2 Th17 细胞的分化
• 1.2 Th17 细胞与抗感染免疫
• 1.2.1 IL-17A
• 1.2.2 IL-22
• 1.2.3 IL-21
• 1.3 乳房炎研究进展
• 1.3.1 乳房炎概述
• 1.3.2 乳腺免疫
• 1.3.3 乳房炎的损伤机制
• 试验研究
• 第二章 奶山羊IL-17、IL-21 和IL-22 的克隆与序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌种和载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要溶液配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 奶山羊外周血淋巴细胞的分离与刺激活化
• 2.2.3 淋巴细胞总RNA 提取
• 2.2.4 反转录和PCR 扩增
• 2.2.5 构建克隆载体
• 2.2.6 目的基因序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 目的基因RT-PCR 扩增结果
• 2.3.2 克隆载体鉴定结果
• 2.3.3 序列分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 CaIL-17 的克隆
• 2.4.2 CaIL-22 的克隆
• 2.4.3 CaIL-21 的克隆
• 2.5 小结
• 第三章 CaIL-17 和CaIL-22 在大肠杆菌中的表达及其多抗制备
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 菌种和载体
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 主要溶液配方
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 目的片段克隆
• 3.2.3 原核表达载体的构建
• 3.2.4 重组质粒的诱导表达
• 3.2.5 诱导表达条件优化
• 3.2.6 表达产物检测
• 3.2.7 重组蛋白纯化
• 3.2.8 重组蛋白多克隆抗体的制备
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 目的片段的扩增
• 3.3.2 重组质粒的鉴定
• 3.3.3 SDS-PAGE 电泳
• 3.3.4 最佳诱导表达条件的确定
• 3.3.5 蛋白纯化
• 3.3.6 Western blotting
• 3.3.7 多克隆抗体的制备及IgG 粗提
• 3.4 讨论
• 3.4.1 目的蛋白的表达
• 3.4.2 多克隆抗体的制备
• 3.5 小结
• 第四章 奶山羊IL-17、IL-21 和IL-22 在昆虫细胞中的表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 质粒、菌株和细胞
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.1.4 主要溶液配方
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组转移载体的构建
• 4.2.2 重组杆状病毒穿梭载体的构建
• 4.2.3 重组杆状病毒的获取
• 4.2.4 重组蛋白的表达
• 4.2.5 重组蛋白活性检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组转移载体的鉴定
• 4.3.2 重组穿梭质粒的鉴定
• 4.3.3 转染后细胞病变观察
• 4.3.4 表达产物的WB 分析
• 4.3.5 表达产物活性检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 重组Bacmid 构建
• 4.4.2 重组蛋白表达
• 4.4.3 重组蛋白活性检测
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介