小鼠TGF-β１shRNA真核表达载体的构建及其对胚胎发育早期平滑肌细胞分化的影响

论文摘要

研究背景及目的血管发育在胚胎期器官发育、成熟以及成体后组织损伤修复中均起重要的作用。血管平滑肌增生是许多心血管疾病诸如高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等发病的始动环节。成体血管中血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）是特异性较高的细胞,其主要功能是收缩,参与调节血压和维持组织器官的血流灌注。成体VSMC处于增殖和合成能力较低的分化表型;然而在某些病理条件如动脉粥样硬化和血管成形术后,VSMC呈现高合成、高增殖的合成表型。VSMC由分化表型转变为合成表型是某些心血管疾病发生的重要病理基础,因此对VSMC分化的调控机制研究是临床上防治增生性心血管病的前提。研究细胞分化常用的模型是胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）。ES细胞分离于早期胚胎的内细胞团（inner cell mass, ICM）,具有自我更新和多向分化潜能两大显著特性,是研究早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育学事件的一个理想模型。胚胎小体（embryonic bodies, EB）是ES细胞在去白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor, LIF）培养下自发形成的细胞团,它可以模拟体内早期胚胎发育的全过程,是研究VSMC谱系分化成熟的理想体外模型。RNA干扰技术是近年来发展起来的基因功能研究工具。本实验旨在利用RNA干扰技术建立转化生长因子β1（transforming growth factorβ1, TGF-β1）shRNA真核表达载体,研究TGF-β1在胚胎发育早期对VSMC分化的影响。TGF-β1是一种多功能的细胞因子,参与调节早期胚胎发育,尤其对心血管系统的发生、发展起着重要的作用;然而其调控VSMC分化、迁移、增殖等过程的机理目前并不十分明确。本实验成功构建了TGF-β1shRNA真核表达载体并转染ES细胞,通过建立EB二维分化模型观察了SMα-actin阳性细胞的分化特点,初步探讨了TGF-β1对胚胎早期VSMC分化的影响。方法1.小鼠TGF-β1shRNA真核表达载体的构建根据GenBank小鼠TGF-β1mRNA序列,设计合成三对短链寡核苷酸,退火后形成双链DNA并克隆至入门载体pENmH1c。将插入目的基因片段的入门载体与带有绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）标签的shRNA真核表达载体pDShpEy进行LR重组反应,完成三个TGF-β1shRNA表达载体的构建,分别命名为pDSTa、pDSTb和pDSTc。并同时构建阴性对照载体命名为pDST0。2. NIH/3T3细胞的培养和质粒的转染用0.25%胰酶及0.53 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）室温下消化融合的NIH/3T3细胞,传代至3.5cm细胞培养皿,待细胞生长至50%70%融合时,按Lipofectamine2000说明书用脂质体将pDST0、pDSTa、pDSTb和pDSTc真核表达载体转染至NIH/3T3细胞,并在含有G418的选择性培养液中培养和筛选,10d后得到稳定表达上述载体的细胞克隆。3.克隆的扩增和鉴定稳定转染pDST0、pDSTa、pDSTb和pDSTc真核表达载体的NIH/3T3细胞克隆扩增后分别提取总RNA和总蛋白,用RT-PCR和Western Blot检测TGF-β1的表达差异,鉴定表达载体沉默效率。同时利用BrdU掺入和流式细胞术观察TGF-β1表达下调后对NIH/3T3细胞增殖功能的影响,从功能上鉴定上述载体的沉默效率。4.小鼠ESCs的培养小鼠ESCs培养于经丝裂霉素C（mitomycin C, MMC）10μg/mL处理2 h的饲养层细胞STO（小鼠胚胎成纤维细胞株）上。当ESCs生长至亚融合时进行传代,每天换液以维持其未分化状态。5. TGF-β1shRNA ESCs株的建立将小鼠ESCs接种于0.1%明胶包被的六孔板中,待细胞生长至约50%70%融合时,按Lipofectamine2000说明书用脂质体将TGF-β1shRNA载体pDSTc和阴性对照载体pDST0转染至ESCs,18h后细胞传代至100 mm细胞培养皿中,以500 mg/L G418进行筛选,1w后在荧光显微镜下挑取GFP阳性单克隆并传代。6. EBs二维模型的建立ESCs培养至亚融合状态,用0.25%胰酶及0.53 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA）消化后,接种到明胶包被的培养皿中实施选择性筛选,3 h后大部分STO细胞已贴壁。将未贴壁的ESCs稀释后接种于细菌培养皿中,培养液除无白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）外与ESCs培养液相同。悬浮培养5d后,将EBs接种于0.1%明胶铺被的培养皿中贴壁培养,制备二维模型;7.免疫细胞化学染色固定的EBs经0.05 mol/L TBS洗涤后,在含0.25% Triton X-100和0.5 mol/L NH4Cl的TBS中通透20 min。5%山羊血清室温封闭1 h后,与一抗在4°C孵育过夜。一抗为SMα-actin。不加一抗做阴性对照片。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC）或异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记抗体。8. RT-PCR参照Trizol说明书,提取不同时间点EBs中的RNA。取RNA 1μg进行SMα-actin、myocardin及GAPDH的半定量PCR。9.蛋白质印迹分析参照常规方法,提取不同时间点ESCs及EBs中的总蛋白,然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、抗体结合及显色。一抗分别为SMα-actin、myocardin和β-actin抗体。用增强型化学发光试剂盒检测目的蛋白。结果1.稳定表达TGF-β1shRNA的NIH/3T3细胞筛选以浓度为500mg/L的G418筛选稳定表达TGF-β1shRNA的NIH/3T3细胞。在荧光显微镜下可观察到转染的细胞表达GFP。2. TGF-β1shRNA表达载体对NIH/3T3细胞TGF-β1表达的影响RT-PCR和蛋白质印迹分析结果显示,转染pDSTa、pDSTb和pDSTc真核表达载体的细胞其TGF-β1mRNA和蛋白表达水平较对照组pDST0呈现不同程度下调,以pDSTc组最明显。3. TGF-β1表达下调对NIH/3T3细胞增殖功能的影响以BrdU掺入实验检测干扰载体对细胞增殖能力的抑制作用,结果显示,转染pDSTa、pDSTb和pDSTc的细胞BrdU染色阳性率均较pDST0组明显减少,以pDSTc组减少最为显著,提示后者具有较强基因沉默效率。同时采用流式细胞术（flow cytometry, FCM）分析细胞周期,结果显示转染pDSTa、pDSTb和pDSTc的细胞均较对照组pDST0出现明显G1期阻滞,其中以pDSTc组G1期阻滞最为明显。4.稳定表达TGF-β1shRNA的ESCs筛选及鉴定于荧光显微镜下挑取表达GFP的pDSTc和pDST0阳性ESCs克隆并传代扩增。以Western Blot检测上述两种ESCs克隆及其在分化成EBs后TGF-β1的表达变化,结果显示pDSTc阳性ESCs克隆及EBs的TGF-β1蛋白表达较pDST0对照组明显降低。5. EBs各发育阶段的形态结构EBs经悬浮培养后迅速分化,1d2d后可形成典型的简单EBs（simple embryoid bodies, SEBs）,随培养时间延长,SEBs进一步分化形成成熟囊性EBs（cystic embryoid bodies, CEBs）,CEBs具有类似早期胚胎的原始内胚层、基底膜、柱状原始外胚层及囊腔等结构。6. TGF-β1表达下调对EBs二维分化模型形态学的影响悬浮培养5d的EBs接种于明胶包被的24孔板中,EBs贴壁后第2d对SMα-actin免疫荧光染色阳性细胞即平滑肌样细胞分布特点进行观察,结果显示转染pDST0载体的对照组EBs贴壁分化后,90%以上SMα-actin免疫荧光染色阳性细胞随着分化时间的延长散在分布于EBs延伸细胞的周边。转染pDSTc载体的EBs分化早期SMα-actin免疫荧光染色阳性的细胞成群出现在EBs边缘细胞密集处,且分化细胞向周边延伸速度较慢。7. TGF-β1表达下调对EBs分化不同时期VSMC分化标志物表达的影响对两组EBs实施RT-PCR和Western Blot检测SMα-actin和myocardin两组分化标志物在表达初期和表达高峰期的差异,结果显示转染pDSTc载体的EBs在发育过程中SMα-actin和myocardin的表达均低于转染pDST0载体的阴性对照组,提示TGF-β1可明显影响VSMC的分化。结论1.带有GFP标签的TGF-β1shRNA真核表达载体能够阻断ESCs及EBs TGF-β1基因表达,可作为研究TGF-β1调控血管发育机制的一个工具;2. TGF-β1表达下调可抑制EBs二维分化模型中平滑肌样细胞的分化,且SMα-actin染色阳性细胞主要密集分布在EBs周围分化细胞群边缘,细胞向周边延伸速度减慢;3. ESCs及其形成的EBs TGF-β1表达降低后,VSMC分化标志物表达明显降低,提示TGF-β1可以促进胚胎发育早期VSMC的分化。4.利用RNAi技术构建特定基因表达下调的ESCs及EBs模型可以作为一种理想的替代基因敲除的分子生物学工具用于基因功能学的研究。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 绿色荧光蛋白标记的TGF-β15hRNA 真核表达载体的构建及鉴定
• 1. 引言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 6. 图片
• 参考文献
• 实验二 TGF-β1shRNA 小鼠胚胎干细胞株的建立及其向平滑肌细胞分化的初步研究
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 6.图片
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢