论文摘要
脱落酸（abscisic acid，ABA）是一种重要的植物激素，是植物在干旱、低温、盐胁迫等逆境胁迫下产生应激反应的启动者（Addicott et al.,1968）[1]。作为内源信号，其对植物在胁迫环境下的生长、发育都有重要的调节作用Zeevaart and Creelman，1988；Leung and Giraudat，1998)[2]-[3]。研究表明，ABI1、ABI2是脱落酸（ABA）信号传导途径中的信号元件，介导ABA信号的产生（Rodriguez 1998；Gosti et a1．，1999）[4]-[5]。由于ABA在胁迫条件下对植株的气孔关闭等生理性状有着调节作用，因此研究ABA的发生机理以及探索ABA信号途径当中新的信号因子，对研究植株在外界环境改变时所作出的适应性反应有一定的意义。酵母双杂交系统是检测蛋白质之间是否存在相互作用的有效途径（Field et a1．，1989）[6]，在探索新的ABA信号元件中能够筛选出与已知信号因子相互作用蛋白质（Chien et al.,1991）[7]，从而预测未知蛋白在信号途径中的作用。现已通过酵母双杂交系统在拟南芥cDNA文库中筛选出与ABI1、ABI2都有相互作用的两个未知蛋白，其编码基因为未知基因（GenBankAB025622，AC023628），因此预测这两个基因所表达产物是ABA信号途径中的调控因子。根据其发现顺序将这两个基因暂时命名为pcr7（AB025622）和pcr9（AC023628）。在获得两个未知基因之后，分别与拟南芥基因组文库进行序列比对，之后设计引物拉出全长编码序列，构建真核生物表达载体pBI121以及包含反向插入片段的载体，利用农杆菌介导的花序浸染法（Clough and Bent,1998）[8]将这两个未知基因导入拟南芥，以期获得这两个基因的高表达量和通过同源序列的干扰抑制作用从而产生的低表达量的转基因植株。根据GenBank数据库中拟南芥的cDNA文库进行酵母双杂交筛选后的基因比对。可知pcr7基因序列为全长编码序列，而pcr9基因除起始密码子外其它编码序列与文库中的序列一致。运用primer5.0软件为pcr7设计引物。根据后续实验设计在pcr9的引物前加一起始密码子、SmaI酶切位点以及保护碱基。以已连有pcr7完整序列和缺少起始密码子的pcr9部分完整序列的酵母载体pGAD10为模版，进行PCR扩增，获得600bp左右的片断。序列克隆到pMD18-T载体上，并分别挑出两种基因反向插入的重组子。测序结果通过与cDNA文库比对证实这两个片段为拟南芥中的两个未知序列，并且不存在内含子区域。基因序列表明这两个片段也可通过构建原核表达载体从而在大肠杆菌中得到表达。通过限制性内切酶SmaI单酶切分别含有两个基因的pMD18-T载体重组质粒，将得到pcr7、pcr9基因的平端片断。将这两个片段分别连接至已用SmaI、Ecll36Ⅱ酶切的pBI121质粒中，则得到这两个基因正向插入和反向插入pBI121的真核表达载体。将这四种pBI121重组质粒转化农杆菌EHA105，并转入拟南芥中进行表达，研究这两个基因的功能。将SmaI单酶切pMD18-T载体后获得的两个基因片断分别插入到改造自pGEX-2T载体的GTK载体的SmaI多克隆位点。连接产物转化BL21菌株的感受态细胞，28℃时IPTG诱导表达，分别获得了与理论值相符合的44.18、46.9KD的GST融合蛋白。Western-blotting印迹分析显示，表达的融合蛋白能被抗GST抗体识别。通过亲和层析分离纯化出目标蛋白，进行进一步的基因工程方面的研究。