论文摘要
近年来,氧化应激与各类皮肤损伤的关系日益引起人们的重视,成为外科研究领域的热点,例如光敏性皮炎,白癜风,各种急慢性皮肤溃疡等。氧自由基在其发病过程中起着越来越重要的作用,一方面可以作为信号分子,清除感染的微生物等;另一方面,过量的氧自由基将导致组织损害,不利于创面修复。由于体内具有有效的自由基清除系统,能够维持体内自由基的平衡状态。当体内抗氧化系统不能有效清除氧自由基或产生过多氧自由基时,这种平衡状态改变进而导致氧化应激。因此,抗氧化治疗也是临床治疗相关皮肤疾病的途径之一。本论文选择具有托毒生肌作用的常用中药黄芪,以其有效成分黄芪多糖（Astragalus polysaccharide, APS）为研究对象,分为两部分进行实验研究:第一部分为体内整体实验,选用表柔比星诱导慢性氧化损伤性皮肤溃疡的动物模型,观察黄芪多糖在氧化应激和抗氧化损伤皮肤溃疡修复中的作用;第二部分为体外细胞实验,以H2O2诱导大鼠成纤维细胞氧化应激的细胞模型,研究黄芪多糖抗氧化损伤的作用机制,探讨黄芪多糖与氧化应激损伤、溶酶体、线粒体之间的关系,揭示黄芪多糖干预氧化应激诱导细胞凋亡的调控机制及其作用靶点。1体内研究1.1表柔比星诱导小鼠氧化损伤性皮肤溃疡模型的复制小鼠背部皮内注射表柔比星（2 mg/mL）0.15 mL/只,观察小鼠皮肤溃疡愈合天数及伤口面积;采用HE和Massson染色观察创面的组织学变化,天狼猩红染色观察胶原构建情况。生化法检测小鼠皮肤溃疡局部MDA水平和SOD活力。结果显示:表柔比星注射后3-5 d发生水肿,甚则破损形成溃疡,11-13 d溃疡面积达到高峰,随后逐渐缩小,创面边缘正常皮肤开始生长新毛,28-30 d左右创面愈合形成瘢痕,创面皮肤开始生长新毛。创面组织学分析显示:造模后13 d创口胶原组织破坏,胶原数量减少,结构紊乱,成纤维细胞稀疏,有大量炎细胞浸润,尤以创口周围明显,创周可见明显水肿,坏死; 27 d有毛细血管及纤维组织的增生,表皮细胞重新上皮化,创面逐渐合拢;胶原组织开始重新构建,成熟度较高,但排列紊乱。氧化损伤与抗氧化物酶的结果显示:与正常对照比较,造模后13 d创面组织MDA水平增高组织（p < 0.01）而SOD活力显著降低（p < 0.01）;造模后27 d MDA水平仍然处以较高水平（p < 0.01）而SOD活力较低（p < 0.01）。结论:证实表柔比星皮内注射能够成功的复制氧化损伤性皮肤溃疡模型,可以应用其研究中医外用药对皮肤溃疡的治疗效应和作用机制。1.2 APS对氧化损伤性皮肤溃疡的愈合作用及机制研究以表柔比星诱导小鼠慢性皮肤溃疡模型作为观察对象,检测溃疡面积,HE、Massson和天狼猩红染色法观察创面的组织学变化,生化法检测小鼠皮肤溃疡局部MDA、LDH、SOD水平,免疫组化法检测创面局部组织组织蛋白酶D（Cathepsin D,Cat D ）和Bax蛋白的表达,观察黄芪多糖高剂量（APSH, 0.8 mg/mL）、低剂量（APSL, 0.4 mg/mL）,并以抗氧化剂Trolox（3 mg/mL）和生长因子rhEGF（2000 IU/mL）作为阳性对照药,比较其对小鼠皮肤溃疡的愈合作用,并探讨其作用机制。结果显示:APSH和APSL组小鼠创面结痂早,表现出一定的促进溃疡创面愈合的作用,平均愈合时间为分别为23.25±4.80d和24.44±3.50d,效果好于rhEGF组（26.29±2.50d）,Model组（29.75±3.58d）及Trolox组（29.57±3.03d）。对创面面积进行分析,APS可以明显缩小表柔比星致氧化损伤性皮肤溃疡的面积,其作用效果与阳性对照药物rhEGF相似;而Trolox则起效较晚。造模后13d,APSL及rhEGF能够部分缓解组织损伤的病理改变,创面肉芽组织结构致密,成纤维细胞数量增多,炎症细胞较少,促进胶原生长及表皮细胞修复。Trolox在减轻炎症反应和促进组织愈合方面作用稍差。造模后27d,APSL及rhEGF治疗组动物创面胶原开始构建,排列整齐,成熟度高,接近正常组织。造模后13d时,各组与Control组比较MDA水平增高（p < 0.01）,LDH活力增高（p < 0.01）,而SOD活力显著降低（p < 0.01）;造模后27d溃疡创面基本愈合时,除Model组外,各组异常增高MDA水平明显下降,与Model组比较,rhEGF和APS高、低剂量组治疗效果明显（p < 0.01）,Trolox组也有一定的治疗效果（p < 0.05）。各治疗组LDH活力也明显下降,与Model组比较均有显著的统计学差异（p < 0.01）,各治疗组创面皮肤组织SOD活力均较13d时明显增加,与Model组比较没有显著统计学差异（p > 0.05）,其中Trolox组SOD活力基本恢复正常（p > 0.05）。注射表柔比星后第13d Cat D阳性表达明显增强,与Control组动物创面比较有显著统计学差异（p < 0.01 ）。APS治疗组动物Cat D表达在注射表柔比星后第13d与Model比较有差异（p < 0.01）,尤以APSL效果显著,与Control组比较没有明显差异（p > 0.05）。Bax蛋白在注射表柔比星后第13d后,阳性表达也明显增强,各组Bax蛋白表达与Control组动物创面比较有显著统计学差异（p < 0.01 ）。与Model组比较发现,Trolox组没有明显的治疗效果（p > 0.05）,其余各组在13d时就能明显降低创面组织Bax表达（p < 0.05）,尤以APSL效果显著,其Bax表达在注射表柔比星后第27d后与Control组比较没有明显差异（p > 0.05）。以上动物实验结果提示APS能够促进表柔比星诱导氧化损伤性皮肤溃疡的愈合,缩短创面愈合时间,提高创面愈合质量,其作用机制为减少炎性细胞浸润,促进胶原分泌、结构重建,降低创面脂质过氧化程度和LDH活力,增强抗氧化酶SOD的表达,发挥其抗氧化应激损伤的功效,还与抑制创面细胞的过度凋亡有关。2体外研究基于以上APS对氧化损伤性皮肤溃疡的促愈作用和机制,以大鼠皮肤成纤维细胞氧化应激损伤作为体外研究的模型,进一步在细胞和分子水平探讨了APS抗氧化应激凋亡的机制,寻找其有效作用靶点。2.1 APS对H2O2引起大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤的调节作用H2O2,0.5 mM刺激大鼠成纤维细胞30分钟后加入含不同浓度APS的新鲜培养液继续培养24 h、48 h、72 h后MTT法测细胞存活率;和/或培养1 h、3 h、6 h和24 h后Hoechst 33258染色法观察凋亡时细胞核的变化, Mitotracker Green FM标记,激光共聚焦扫描法观察线粒体形态变化,荧光比色法检测Caspase-9、-3。结果发现,以24 h时正常对照组细胞数为100%,H2O2诱导后细胞数明显下降（p < 0.01）,细胞存活率下降到仅为35.23%,48 h继续下降为31.80%,72 h为35.80%。24 h时,APS在1μg/ml终浓度时,可以明显增高细胞存活率到52.52%±1.84%;48 h和72 h时,在0.5μg/ml - 2μg/ml浓度范围内,APS能够显著增加细胞存活率,尤以APS终浓度为1μg/ml时,对细胞存活率作用最显著。因此,选用1μg/ml的浓度进行APS抗氧化损伤机制的研究。H2O2处理3 h可见波纹状或折缝样细胞核,6 h可见部分染色质出现浓缩状态, 24 h后多数细胞核会呈致密浓染,有凋亡小体出现,而APS能够明显降低凋亡细胞的百分比。H2O2作用于大鼠成纤维细胞1 h后线粒体即由生理状态下的线管状、网状断裂成圆点状、粒状。3 h时呈现典型的变化,线粒体的分布也由遍布细胞向核周围集中。这种变化直到24 h也未见完全恢复,经过APS治疗的细胞可以减轻这种改变,细胞仍呈现线管状、网状,并且弥漫分布在胞浆中。Caspase-9和-3分别在H2O2处理后6 h和24 h有最大程度活化,APS治疗后能够显著抑制这种活化（p < 0.01）,与正常值接近（p > 0.05）。以上结果提示:H2O2能够诱导细胞发生氧化应激凋亡,细胞凋亡时一系列事件随时间级联发生,而APS能够抑制调亡发生并且具有作用的多靶点效应。2.2 APS抑制H2O2诱导大鼠成纤维细胞氧化损伤细胞内ROS产生,保护线粒体和溶酶体上述成纤维细胞模型,分别用H2DCFHDA、JC- 1和丫啶橙（Acrodine orange, AO）标记,激光共聚焦扫描法检测细胞内ROS的产生,线粒体膜电位的改变和溶酶体稳定性。结果显示:0.5 mM H2O2刺激大鼠成纤维细胞30 min后,以PBS彻底冲洗,加入新鲜的培养液,1 h后就可观察到大量的细胞内ROS释放,经APS处理过的细胞在1 h ROS释放量就略有减少（p < 0.05）,3 h降低非常明显。H2O2处理后细胞线粒体膜电位水平在1 h就显著降低（p < 0.01）,加入APS细胞线粒体膜电位水平有显著升高,并成时间依赖性,6 h和24 h与正常对照组性比较没有统计学差异（p > 0.05）。在细胞氧化应激的超早期,即H2O2刺激后15 min,APS就可保护溶酶体膜的稳定性。结果提示: APS可以抑制ROS产生,恢复去极化的线粒体膜电位而对生理状态的线粒体膜电位没有作用,从而在APS能够在线粒体和溶酶体水平负调控细胞氧化应激凋亡。2.3 APS对H2O2诱导大鼠成纤维细胞氧化损伤时细胞内组织蛋白酶D和Bax的表达免疫组化法检测和免疫荧光化学法分别测定APS对氧化应激时皮肤成纤维细胞Cat D和Bax表达的影响。结果表明:H2O2处理1 h后细胞Cat D表达迅速增加,到24 h时略有下降,但与Control组比较仍有显著差异（p < 0.01）。APS治疗后,1 h表达明显减弱（p < 0.01）,这种差别一直持续到24 h。H2O2处理后细胞浆Bax表达随时间增强,至24 h出现高峰,与Control组相比,有显著统计学差异（p < 0.01）。APS治疗组细胞与H2O2组比较,Bax表达明显减少（p < 0.01）。结果提示:APS能够抑制氧化应激时皮肤成纤维细胞Cat D的表达,并通过Bax表达下调,从而稳定线粒体膜电位,达到抑制凋亡发生的目的。以上APS抗氧化应激机制的体外研究结果表明:氧化应激时,溶酶体膜不稳定、线粒体形态改变、caspases活化、细胞核形态变化、细胞死亡等事件是照一定时间顺序发生的;而APS不但可以调节上述凋亡的各个关键效应靶点,而且可以抑制ROS的产生,从而在一定程度上阻断氧化应激引起调亡的级联放大反应,还能够通过在线粒体和溶酶体之间调节Cathesin D和Bax表达来保护线粒体,本论文证实了APS抗氧化应激凋亡作用的多靶点及其机制。综上所述,本论文从体内和体外模型研究阐明了APS促进表柔比星诱导慢性氧化损伤性皮肤溃疡的愈合,具有抗氧化应激损伤的功效,还能够抑制创面细胞凋亡。其抑制氧化应激凋亡的机制与保护线粒体和溶酶体,减少细胞内ROS产生,抑制凋亡相关Cat D和Bax表达有关,本论文揭示了黄芪多糖干预氧化应激诱导细胞凋亡的调控机制及多个作用靶点。