万古霉素耐药肠球菌分子特征及遗传背景研究

论文摘要

研究背景万古霉素耐药肠球菌（VRE）是重要的医院内感染病原菌,由于治疗选择严重受限经常伴有较高的致病率和致死率。近年大量研究显示,VRE菌株主要来自抗生素的压力对肠道菌的筛选,这种抗生素筛选出的定植VRE菌株更易引起医院内感染及播散。甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）也是一类重要的医院内感染菌,其具有临床分离率高、致病力强等特点,MRSA一旦接受VRE的vanA基因发展为VRSA,将会给现有的抗感染治疗体系带来巨大困难。研究目的1.我们对从2008年3月至2009年3月卫生部北京医院临床标本中分离得到32株VRE菌株进行了分子特征及遗传背景研究。2.2010年底至2011年初我们对北京医院住院处病人进行了VRE的定植研究,以明确我院VRE菌株的定植情况,及VRE易于出现定植的临床病例特征。3.对我院同一病人同时感染和／或定植MRSA和VRE菌株的病例及菌株进行了研究和分析,以期为医院内感染控制措施的制定提供一定理论依据。研究方法1.对2008年3月至2009年3月临床标本中出现的VRE菌株的研究：1)应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型技术（MLST）进行遗传背景研究。2)采用重叠PCR技术对转座子Tn1546的结构进行分析,同时检测常见毒性基因esp、hyl,及主要耐药基因van基因和aac（6’）-aph（2"）。3)在对菌株进行分子特征及遗传背景研究的同时,收集病人的临床资料并对病房环境进行监测。4)应用转移接合试验对转座子Tn1546的转移接合活性进行研究分析。2.对VRE定植菌株的研究：1)评价自制的含6μg/ml万古霉素血琼脂培养基和法国生物梅里埃公司的chromIDVRE筛选培养基。方法：选取已知VRE菌株30株、VSE菌株30株、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA） 20株、其它链球菌20株分别接种两种筛选培养基,评价两种培养基的准确度和特异性；然后应用两种培养基对350份住院处病人便标本进行VRE菌株的筛选,对确证的定植VRE菌株我们应用Etest进行药物敏感试验。2)应用PCR和测序技术对定植VRE菌株的MLST、转座子Tn1546结构、耐药基因及毒性基因等主要分生物学特征进行研究。3)收集病例分析出现VRE定植的病例的主要特征。3.对我院近期临床发现的具有金黄色葡萄球菌及VRE感染和/或定植的病例的研究：1)收集和分析病例资料。2)应用Etest法对金黄色葡萄球菌及VRE进行药物敏感试验。3)采用PCR和测序技术对VRE的主要分子生物学特征进行研究。4)应用接合试验研究Tn1546转座子的转移接合活性。研究结果1.对2008年3月至2009年3月临床标本中出现的VRE菌株的研究：1)32株VRE菌株有21株来自感染病人,11株为定植菌株；从病房分布来看有21株分离自急诊重症监护病房,9株来自老年病房,另2株散在于其它病房。2)所有菌株均为vanA基因阳性,其它基因阴性,但有4株菌表现为VanB表型,即万古霉素耐药,替考拉宁敏感；转座子Tn1546结构分析显示：ISEfa4的插入和vanY或vanZ基因的缺失与基因型与表型不一致相关。3)PFGE分析显示VRE菌株存在一定程度的院内播散；MLST分析提示所有菌株均为CC17克隆复合体,CC17菌株近年已造成了全球的播散。4)对感染病房环境的监测未发现环境污染现象。2.对定植VRE菌株的研究：1)对已知菌株,两种培养基准确度、特异性均可以达到100%。2)对350份临床便标本进行VRE筛查,共筛选出15株VRE菌株,菌株均为屎肠球菌,VRE定植率为4.3%,15株定植VRE菌株全部表现为多重耐药,所有菌株均表现为VanA表型,并拥有vanA基因。3) MLST分型显示所有菌株亦均属于更适合医院内生长的CC17克隆复合体,易形成医院内感染。4)所有检出VRE菌株定植的病人均具有较严重基础疾病,并接受过头孢菌素和糖肽类药物的治疗。3.对同一病人同时感染/定植VRE和MRSA的研究：1)2010年10月-2011年2月我院共发现8例同时感染和/或定植VRE和金黄色葡萄球菌的病例,药敏结果显示：8株金黄色葡萄球菌全部为MRSA,并对多种药物呈现多重耐药,VRE菌株全部为VanA表型并vanA基因。2)VRE菌株毒性基因esp全部阳性,hyl只有1株菌表现阳性；转移接合试验中,有7株VRE菌株含vanA基因的质粒转移接合成功,只有1株菌失败。3)8例病人全部接受过糖肽类药物的治疗,并具有较严重基础疾病。结论1.我们应该重视VRE菌株的监测,同时制定更严格、有效的医院内感染控制措施,以有效降低医院内感染的出现。2.发现了我国罕见的VanB表型-vanA基因型VRE菌株,Tn1546结构的改变影响了vanA基因的表达。3.在国内首次对定植VRE菌株的定植率及定植菌株分子生物学特征进行了研究,结果表明医院内定植VRE菌株比例不能忽视,应该对定植VRE菌株进行严密监测,以有效减少VRE菌株的院内播散。4.对同时感染和/或定植VRE和MRSA的病例的研究国内可查到的文献极少,我们的研究表明这种共感染的现象在我国已不罕见,应该进一步规范抗生素的应用,降低VRE和MRSA比例；并采取适当措施,以阻止或延缓VRSA在我国的出现。

论文目录

• 英文缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分:VRE临床分离菌株的分子特征及遗传背景研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 主要药敏试剂
• 1.1.3 分子生物学试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 主要试剂配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 VRE菌株的筛选
• 1.3.2 药敏试验
• 1.3.3 VRE菌株DNA的提取
• 1.3.4 VRE菌株耐药基因的检测
• 1.3.5 重叠PCR扩增携带vanA基因的转座子Tn1546
• 1.3.6 毒性基因的检测
• 1.3.7 PCR产物的克隆
• 1.3.8 核苷酸序列测定
• 1.3.9 质粒接合试验
• 1.3.10 脉冲场凝胶电泳（PFGE）
• 1.3.11 多位点序列分型（MLST）
• 2 结果
• 2.1 菌株收集
• 2.2 药敏试验结果
• 2.3 耐药基因分布
• 2.4 毒性基因的分布
• 2.5 接合试验结果
• 2.6 遗传背景研究（MLST和PFGE）
• 2.6.1 脉冲场凝胶电泳结果
• 2.6.2 多位点序列分型结果
• 2.7 转座子Tn1546结构研究
• 3. 讨论
• 4. 参考文献
• 第二部分:定植VRE菌株的筛查及分子特征研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 主要药敏试剂
• 1.1.3 分子生物学试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 主要试剂配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 VRE菌株的筛选
• 1.3.2 VRE菌株确认
• 1.3.3 VRE菌株DNA的提取
• 1.3.4 VRE菌株万古霉素耐药基因的检测
• 1.3.5 VRE菌株毒性基因的检测
• 1.3.6 Tn1546转座子结构研究
• 1.3.7 VRE菌株多位点序列分型
• 1.3.8 PCR产物克隆
• 1.3.9 核苷酸序列测定
• 1.3.10 收集临床病例资料研究
• 2. 结果
• 2.1 VRE定植菌株收集
• 2.2 两种VRE筛选平板比较
• 2.3 药敏试验结果
• 2.4 耐药基因和毒性基因的分布
• 2.5 多位点序列分型结果
• 2.6 转座子Tn1546结构
• 3. 讨论
• 4. 参考文献
• 第三部分:同一病人同时感染/定植MRSA和VRE的研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细菌来源
• 1.1.2 主要药敏试剂
• 1.1.3 培养基来源
• 1.1.4 青霉素结合蛋白检测试剂
• 1.1.5 主要分子生物学试剂
• 1.1.6 主要仪器
• 1.2 主要试剂配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 VRE菌株筛选
• 1.3.2 VRE菌株确认
• 1.3.3 金黄色葡萄球菌鉴定
• 1.3.4 VRE菌株DNA提取
• 1.3.5 万古霉素耐药基因检测
• 1.3.6 毒性基因检测
• 1.3.7 PCR产物克隆
• 1.3.8 核苷酸序列测定
• 1.3.9 青霉素结合蛋白检测
• 1.3.10 质粒接合试验
• 1.3.11 收集病例资料
• 2. 结果
• 2.1 VRE菌株收集结果
• 2.2 抗生素敏感试验结果
• 2.2.1 VRE菌株药敏试验结果
• 2.2.2 金黄色葡萄球菌药敏试验结果
• 2.3 质粒接合试验
• 3. 讨论
• 4. 参考文献
• 全文总结
• 论文综述
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章
• 附录1 E28 ISEfa4测序图（正向）
• 附录2 E28 ISEfa4测序图（反向）
• 附录3 VanB表型-vanA基因型VRE vanA基因测序图（E28）
• 附录4 ISEfa4的核苷酸序列拼接图