丁香假单胞菌HrpA单克隆抗体的制备及scFv抗体库的构建

论文摘要

Hrp（hypersensitive response and pathogenicity,Hrp）基因广泛存在于植物病原细菌中,参与Hrp极毛系统的组装,不仅可运输效应蛋白至植物细胞,导致HR（过敏性反应）或抗病性,还可运输致病性和毒性蛋白或抑制子活性物质,引起植物病害。hrp基因多串联成簇且相当保守,在诱导培养基或植物体内,基因簇中的hrpA基因编码细菌表面附属物-Hrp极毛的结构蛋白HrpA。Hrp极毛在植物-病原细菌互作中扮演十分重要的角色。病原细菌能否使亲和性植物发病与其是否有Hrp极毛有直接的关系。在对hrp基因进行深入研究的基础上,我们尝试设计新的化学药剂和抗体阻止HrpⅢ型分泌系统的组装或致病毒力蛋白因子的分泌运输,从而有效限制植物细菌病害的发展。本研究以丁香假单胞菌番茄变种DC3000（Pseudomonassyringae pv.tomato DC3000）hrp基因表达的工程蛋白HrpA/Ps作为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备单克隆杂交瘤细胞抗体,然后从杂交瘤细胞系中提取RNA,反转录合成cDNA,并以此为模板,PCR扩增获得全套抗体的可变区基因,利用从PQY1.5质粒扩增出一柔性肽段（Linker）连接成基因工程单链抗体（single chainvariable fragment,scFv）,再通过基因工程方法,将scFv与噬菌粒pCANTAB-5E连接,转化大肠杆菌TG1菌株,获得单链抗体噬菌体文库,以便利用噬菌体展示技术对抗体库进行淘选,获得了HrpA特异性的单链抗体。以单克隆抗体为来源的单链抗体,亲和力和特异性都较好,可以为进一步进行植物抗病基因工程和植物抗体研究提供基因来源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 2 文献综述
• 2.1 植物病原细菌hrp基因
• 2.2 抗体工程
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 动物及菌株
• 3.1.2 试剂与材料
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 PCR引物
• 3.2 方法
• 3.2.1 HrpA抗原蛋白的制备
• 3.2.2 抗原蛋白免疫小鼠
• 3.2.3 免疫小鼠尾部取血测定血清效价
• 3.2.4 细胞融合
• 3.2.5 HAT选择杂交瘤及抗体检测
• 3.2.6 有限稀释法单克隆化杂交瘤
• 3.2.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 3.2.8 单克隆抗体的型及亚类鉴定
• 3.2.9 单克隆抗体亲和常数的测定
• 3.2.10 杂交瘤细胞RNA提取
• 3.2.11 Scfv片段的构建
• 3.2.12 pcANTAB 5E-scFv噬菌体库的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 抗原蛋白HrpA的制备
• 4.2 免疫小鼠血清效价的鉴定
• 4.3 细胞融合
• 4.4 杂交瘤细胞的筛选和克隆化
• 4.5 HrpA单克隆抗体类型及亚类的鉴定
• 4.6 HrpA单克隆抗体亲和力常数的测定
• 4.7 pCANTAB 5E-scFv重组质粒的构建
• 5 小结与讨论
• 5.1 HrpA的制备
• 5.2 细胞的融合
• 5.3 杂交瘤细胞RNA的提取
• 5.4 scFv的组装和扩增
• 5.5 噬菌体抗体库的构建
• 5.6 后续研究
• 5.7 应用前景
• 参考文献
• 附录
• 致谢