论文摘要
目的：观察土槿皮乙酸（PAB）对体外培养的人眼Tenon’s囊成纤维细胞（HTCF）的增殖和凋亡的影响,并比较不同浓度及不同作用时间时,药物作用的强弱,寻求辅助治疗和预防青光眼滤过手术后复发的新途径。方法：取材青光眼手术患者的结膜下Tenon’s囊组织,应用组织贴壁法进行成纤维细胞的体外培养,传代后选取第三或第四代细胞。1.正常Tenon’s囊成纤维细胞的鉴定：制备细胞爬片后对其进行HE染色,并用免疫组织化学SP法抗波形蛋白抗体、抗波形蛋白抗体进行细胞鉴定。2.MTT比色法检测土槿皮乙酸对HTCF增殖的影响：用0～160μmol/等不同浓度PAB作用于体外培养的HTCF,12-96h等不同时间观察HTCF的增殖情况,并采用MTT比色法检测HTCF的生长活性。3.用免疫组织化学SP法检测bcl-2蛋白在HTCF中的表达情况及PAB对其表达的影响：用0～160μmol/L等不同浓度PAB作用于HTCF48h,用免疫组织化学SP法检测Bcl-2蛋白表达情况。结果：1.体外培养的正常人Tenon’s囊成纤维细胞,一般呈长梭形或三角形,胞核呈椭圆形,位于细胞中央,胞浆丰富,生长能力旺盛,呈放射状、编织状、瀑布状或螺旋状排列。2.用免疫组织化学SP法染色传代后的第三或第四代成纤维细胞内,可见波形蛋白表达呈阳性,角蛋白染色呈阴性。而波形蛋白的阳性表达位于细胞胞浆内,可见与细胞长轴方向相同的棕黄色束状或者网状结构。3.在4～60μmol/L作用12-72h的范围内,MTT法检测出PAB能显著抑制HTCF的增殖（P<0.05）,呈剂量和时间依赖性。当作用时间为12h,PAB浓度为：0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、25μmol/L40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、时,抑制率分别为：2.33%、4.33%、8.33%、18.00%、56.00%、61.00%、64.67%、67.67%、68.33%、71.33%、77.00%。当时间为48h,PAB浓度为：0.5"μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、25μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、160μmol/L时,抑制率分别为：1.48%、6.14%、9.11%、51.69%、75.21%、77.33%、81.57%、83.35%、84.75%、86.65%、88.56%。当作用时间为72h,PAB浓度为：0.5}μmol/L、lμmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、25"μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、时,抑制率分别为：1.41%、4.08%、8.63%、65.78%、83.05%、84.14%、86.81%、87.28%、88.38%、90.42%、91.21%。当PAB浓度≥4 umol/L,可见成纤维细胞的增殖受到明显抑制（P<0.05）。当PAB浓度在4-60 umol/L的范围内,抑制作用随着药物浓度的升高而加强（P<0.05）。而当PAB浓度超过60μmol/L时,抑制作用升高不明显（P>0.05）。药物作用成纤维细胞12～72h的时间内,抑制作用随着作用时间的延长而加强,但当作用时间超过72h后,抑制作用增加就不那么明显了,呈饱和效应动力学特征。其中当PAB作用72h,药物浓度160μmol/L时对细胞的抑制作用最显著（P<0.05）,其细胞抑制率为91.21%,镜下成纤维细胞几乎凋亡。4.当PAB浓度≥4umol/L,作用48h时,能浓度依赖性的抑制HTCF表达bcl-2（P<0.05）。在阴性对照组中Bcl-2的阳性率为84±1.23%,而药物组的阳性率分别为：81±1.02%（0.5μmol/L组）,76±0.78%（1μmol/L组）,70±1.10%（2μmol/L组）,47±0.09%（4μmol/L组）,21±0.64%（8μmol/L组）,15±0.89%（16μmol/L组）,12±0.25%（25umol/L组）,9±1.03%（40μmol/L组）,5±0.98%（60μmol/L组）,4±0.07%（80μmol/L组）,2±0.11％（160μmol/L组）。经PAB作用后,Bcl-2在成纤维细胞中的表达明显下降,且经统计学分析,其抑制作用呈剂量依赖关系（P<0.05）。结论：PAB能显著抑制体外培养的HTCF的增殖,且该作用呈剂量和时间依赖性。但当PAB的浓度超过60umol/L、时间超过72h后,HTCF将基本凋亡。PAB有望成为辅助治疗和预防青光眼滤过手术后复发的新型药物。