一个遗传性白内障家系的基因分析及白内障相关Cx50-缝隙连接通道的调控机制研究

论文题目: 一个遗传性白内障家系的基因分析及白内障相关Cx50-缝隙连接通道的调控机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 张先荣

导师: 齐义鹏

关键词: 白内障,基因,缝隙连接通道,钙调蛋白

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 白内障目前已成为全世界首位致盲眼病。据世界卫生组织统计,目前46%的盲人致盲病因源于白内障[Thylefors et al,1995;Lim 1996],其中至少有三分之一的病例是家系遗传性的[Reese et al,1987]。国内外已发现的白内障相关基因有13个（CRYAA,CRYAB,CRYBB1,CRYBB2,CRYBA1/A3,CRYGC,CRYGD,Connexin50,Connexin46,intrinsic membrane protein-LIM2,cytoskeletal protein-BFSP2, the major intrinsic protein-MIP以及heat shock factor-HSF4）。本实验发现了一个成年发病的常染色体显性遗传白内障中国家系,其显著特点是所有患者在成年期才开始出现病症。因此我们对该家系进行了基因突变检测,研究这个家系在已报道的白内障相关基因上是否有致病性突变。针对GenBank公布的以上13个基因57个外显子设计引物,进行PCR扩增并测序。据分析,CRYBB2基因的内含子出现碱基颠换,BFSP2和CRYGD基因外显子各有两处碱基同义突变。但在13个基因中均未发现白内障相关性突变。初步排除了此成年发病的常染色体显性遗传家系的发病与以上13个基因外显子及拼接位点突变相关,但并不能排除外显子以外其他序列突变。对该家系的致病基因还有待于进一步的全基因组扫描研究。 缝隙连接（gap junction）是细胞连接的一种方式,允许分子量小于1.5kD的小分子物质自由通过,对维持组织细胞的内环境稳定和正常生理功能的发挥具有重要意义。由连接蛋白Connexin50（Cx50）所形成的缝隙连接通道对维持眼睛晶状体的透明性起关键作用。在生理状态下,细胞内pH值对缝隙连接通道的门控调节是细胞间的偶联状态改变的重要因素。晶状体组织中由于糖代谢增强造成的pH值降低,引起细胞间缝隙连接通道的功能异常,被认为是造成白内障的一个重要因素。有研究表明Cx50缝隙连接通道对Ca2+及H+浓度敏感[Beahm et al,2002],Ca2+浓度降低则通道被激活,而在细胞内酸性环境下通道关闭[Zampighi

论文目录:

第一篇 白内障家系的相关基因研究

引言

第一章 文献综述

1.1 晶状体概述

1.1.1 晶状体的发育、组织结构及功能特点

1.1.2 晶状体的生理和生化特点

1.2 白内障的诊断

1.2.1 临床症状

1.2.2 眼部检查

1.2.3 临床分期

1.3 白内障的分类

1.4 白内障晶状体的生理生化改变

1.4.1 水和蛋白质组成比例的变化

1.4.2 正常及白内障晶状体的蛋白质组学研究

1.4.3 白内障与离子平衡

1.4.4 白内障与自由基

1.4.5 白内障与维生素

1.4.6 白内障与糖类

1.5 白内障的病因及发病机制

1.5.1 遗传性白内障

1.5.1.1 遗传类型

1.5.1.2 相关基因及突变形式

1.5.1.3 遗传性白内障的研究方法

1.5.2 年龄相关性白内障

1.5.3 紫外线与白内障

1.6 白内障的治疗

1.6.1 手术治疗

1.6.2 药物治疗

1.6.3 基因治疗

1.6.4 晶状体再生

1.7 本研究的背景、目的和意义

第二章 一个常染色体显性遗传白内障家系的基因突变分析

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 家系收集

2.2.2 外周血白细胞提取基因组DNA

2.2.3 引物设计及合成

2.2.4 聚合酶链反应体外扩增目的片断

2.2.5 PCR产物测序

2.2.6 序列分析

2.3 结果

2.3.1 遗传方式及特点

2.3.2 测序结果

2.4 讨论

第二部分 白内障相关Connexin50-缝隙连接通道的调控机制研究

引言

第一章 文献综述

1.1 缝隙连接蛋白及其功能

1.1.1 细胞间通讯联系的发现

1.1.2 缝隙连接的显微结构

1.1.3 细胞间缝隙连接的生理意义

1.1.4 缝隙连接蛋白基因的结构

1.1.5 缝隙连接蛋白

1.1.5.1 缝隙连接蛋白的拓扑结构

1.1.5.2 缝隙连接蛋白不同结构区的功能

1.1.6 缝隙连接功能的调节

1.1.6.1 钙离子浓度

1.1.6.2 PH值

1.1.6.3 电压

1.1.6.4 缝隙连接蛋白磷酸化

1.1.7 缝隙连接通道的门控调节机制

1.1.7.1 缝隙连接蛋白的分子内相互作用

1.1.7.2 缝隙连接蛋白与钙调蛋白之间的相互作用

1.1.8 缝隙连接蛋白与其他蛋白之间的相互作用及意义

1.2 晶状体组织中的缝隙连接

1.2.1 晶状体组织中缝隙连接蛋白的种类及功能

1.2.2 缝隙连接蛋白与先天性白内障

1.2.3 晶状体组织中钙调蛋白及其作用

1.3 缝隙连接半通道

1.4 膜片钳

1.4.1 膜片钳的发现

1.4.2 膜片钳技术的原理

1.4.3 膜片钳技术的基本模式

1.4.4 膜片钳技术的应用

1.4.5 膜片钳记录中细胞膜离子通道的分类

1.5 研究目的与意义

第二章 Connexin50蛋白的分子内及其与钙调蛋白的分子间相互作用

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 菌株、细胞和试剂

2.2.2 目的基因、重组质粒和引物

2.2.3 质粒DNA的制备

2.2.4 DNA片段回收

2.2.5 酶切与连接

2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.7 质粒转化

2.2.8 菌种保存

2.2.9 菌落PCR

2.2.10 细胞培养基的配制

2.2.11 细胞传代培养

2.2.12 细胞冻存

2.2.13 细胞复苏

2.2.14 脂质体介导的真核细胞瞬时转染

2.2.15 免疫共沉淀

2.2.16 Western blot分析

2.2.17 激光共聚焦蛋白质免疫荧光定位

2.3 研究结果

2.3.1 CaM与Cx50之间的蛋白质相互作用

2.3.2 Cx50的分子内相互作用(Cx50CT与Cx50CL)

2.3.3 CaM与Cx50的Ca2+依赖性共定位

2.4 讨论

第三章 钙调蛋白在connexin50半通道功能调节中的作用研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 细胞及试剂

3.2.2 质粒及载体构建

3.2.3 G418筛选稳定细胞系

3.2.4 Lucifer Yellow染料摄取实验

3.2.5 膜片钳实验技术

3.2.5.1 电极拉制

3.2.5.2 细胞内、外液的配制

3.2.5.3 电极充灌

3.2.5.4 信号采集

3.3 研究结果

3.3.1 Ca+及CaM对Cx50半通道通透性的影响

3.3.2 细胞外Ca2+调控Cx50半通道开放状态

3.3.3 CaM参与调控Cx50半通道

3.4 讨论

第四章 pH对Cx50半通道门控调节的可能机制

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.2.1 质粒、细胞及试剂

4.2.2 激光共聚焦蛋白质免疫荧光定位

4.2.3 Lucifer Yellow(LY)染料摄取(dye-uptake)实验

4.2.4 膜片钳技术

4.3 结果

4.3.1 pH 6.5条件下Ca2+对Cx50半通道渗漏性的影响

4.3.2 pH 6.5条件下Ca2+对Cx50半通道电压门控的影响

4.3.3 pH 6.5条件下CaM对Cx50半通道功能的调节

4.4 讨论

研究工作总结

创新点

参考文献

博士期间发表和待发表论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

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