大鼠视网膜干细胞生物学和电生理学特性研究

论文摘要

视网膜退行性变疾病是严重的致盲眼病,对于这类疾病目前尚缺乏有效阻止病变进展和恢复视网膜功能的治疗方法。视网膜干细胞移植是新发展起来并具有广阔应用前景的治疗战略,其中关键性步骤是提供功能良好的视网膜干细胞。就视网膜干细胞的功能研究方面,目前有许多研究者从形态学及神经化学角度证实了视网膜干细胞增殖和分化特性,但是有关视网膜干细胞电生理学特性的研究,目前仅有关于早期和晚期视网膜干细胞电生理学特性研究的比较,而关于从视网膜干细胞到其分化成成熟神经元的过程缺乏系统的电生理学研究。采用分子生物学手段虽然能够了解每个细胞基因的位置和机能,但是并不能彻底研究神经元的电生理特性。众所周知,神经元的基本功能是信号传递,离子和离子通道是产生生物电信号的基础,也是细胞兴奋产生动作电位的基础。电信号在细胞内整合信息,动作电位沿轴突快速传递到末梢,形成生物体细胞间信息传递及神经元回路构建,因此研究视网膜干细胞不同分化阶段神经元样细胞的离子通道特点,对了解这些视网膜干细胞分化后的细胞能否具备神经元的基本功能具有非常重要的意义。膜片钳技术是一种以记录离子通道的电流来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的新技术,从细胞水平观察离子通道机能,且在同一细胞上可观察不同通道的活动。因此对视网膜干细胞的研究如果仅采用分子生物学手段将具有一定局限性,若能将膜片钳技术与形态学、分子生物学等方法相结合,将有利于将视网膜干细胞的生物学特性和电生理特性结合起来,为研究视网膜干细胞提供强有力的理论依据。同时对视网膜干细胞向特异性视网膜细胞分化能力的研究,也是提供功能良好的视网膜干细胞的关键之一。另外,就视网膜色素变性疾病发展过程中是否存在内源性视网膜干细胞进行初步探讨,为寻求挽救视网膜色素变性患者的视功能新的治疗途径提供实验依据。本研究通过分离和培养胚胎大鼠视网膜干细胞,初步探讨特定发育阶段的视网膜外液微环境对视网膜干细胞分化的影响,分析视网膜干细胞不同分化阶段细胞电压门控离子通道的表达特点及其变化趋势,了解视网膜干细胞不同分化阶段细胞的电生理学特性,以期探索视网膜干细胞功能分化的物质基础。并就视网膜色素变性疾病发展过程中是否存在内源性视网膜干细胞进行了初步研究。本研究在上述这些方面做了大量的工作,具体在以下四方面进行研究:第一部分视网膜干细胞的培养及冻存Long Evans胚胎17天大鼠视网膜神经上皮来源的视网膜干细胞培养、传代、冻存、复苏,并对复苏后的细胞进行生物学检测和能否进一步分裂增殖、分化的鉴定,为下面的研究工作做准备。本研究成功建立了培养大鼠视网膜干细胞的方法,获得了可自我扩增传代、性状稳定的视网膜干细胞,在血清诱导分化条件下可分化为多种表达视网膜神经元细胞、神经胶质细胞特异性标志物的细胞。掌握了视网膜干细胞有效冻存和复苏的实验方法,复苏后视网膜干细胞的存活率约为60-70%,细胞性状稳定不发生分化,仍具有自我增殖能力,且可以用血清诱导分化为不同的视网膜细胞。不同的冻存时间对其存活率没有影响。第二部分细胞外液微环境对视网膜干细胞影响的研究1、新生鼠视网膜细胞外液微环境对视网膜干细胞特异性诱导分化的影响本部分通过Transwell共培养装置分层培养大鼠视网膜干细胞和新生鼠视网膜混合细胞,同时以成年阶段（30天龄大鼠）的视网膜混合细胞为对照,观察视网膜干细胞的分化比率变化。由于二者细胞外液相通,但细胞不发生接触,这样可以模拟新生和成年时段时的视网膜外液微环境,研究它们对视网膜干细胞诱导分化的影响。2、视网膜变性鼠视网膜细胞外液微环境对视网膜干细胞的影响将RSCs在Transwell系统中,与RCS大鼠视网膜共培养,在扫描电镜下观察变性视网膜组织分泌物对视网膜干细胞迁移、分化的影响。新生大鼠视网膜混合细胞可能分泌某种物质,可以提高视网膜干细胞向光感受细胞的分化比率,而成熟大鼠视网膜混合细胞不具备此功能,可能与该阶段细胞分化信号途径的关闭有关系;变性视网膜上清液微环境对共培养的干细胞具有趋向诱导作用,并能诱导视网膜干细胞进一步分化,干细胞受到周围组织细胞及细胞外基质的作用和影响可趋向运动并诱导分化。第三部分视网膜干细胞不同分化阶段细胞电生理学特性检测培养大鼠视网膜干细胞,运用全细胞膜片钳技术（Whole-cell Patch Clamp）分析视网膜干细胞不同分化阶段细胞电压门控离子通道的表达特点及其变化趋势,系统和深入地研究大鼠视网膜干细胞分化不同阶段的电生理学特性,以期探索视网膜干细胞功能分化的物质基础。同时将新生鼠视网膜混合细胞外液诱导视网膜干细胞分化与10%胎牛血清非特异性诱导分化的细胞进行了电生理学特性方面的比较研究。在对视网膜干细胞分化不同阶段的细胞行膜片钳全细胞记录的同时,对不同阶段的分化的部分细胞进行细胞内荧光黄（Lucifer Yellow,LY）标记,观察视网膜干细胞分化不同阶段的细胞的形态学特性,并将其与分离培养的相应时间段的视网膜神经元进行比较。目的在于为视网膜干细胞进一步应用于细胞替代治疗视网膜变性疾病提供功能水平上的理论依据。本研究应用全细胞膜片钳法成功记录视网膜干细胞分化不同阶段细胞上表达的多种不同电压门控离子通道,证实了用全细胞膜片钳法进行干细胞分化后离子通道细胞功能检测分析的可行性。采用细胞内注射技术,能清晰地显示在普通显微镜下不能很好观察的细胞形态,对于干细胞的形态特性及功能分析提供了很好的研究手段。1、干细胞分化过程中逐渐发育出电压门控性离子通道,这些通道支持短时程、反复性动作电位的发放;视网膜干细胞与其不同分化阶段神经样细胞拥有不同的电压门控性电流,从细胞功能的水平阐述了该视网膜干细胞及其分化细胞的标志,为今后视网膜干细胞移植从功能角度提供了理论依据。2、大鼠视网膜干细胞分化过程中逐渐发育出电压门控性离子通道,推测离子通道的发育是神经元分化过程中的重要环节,这些通道进一步分化后可支持动作电位发放,表明离子通道的发育是视网膜干细胞分化成具有功能的成熟神经元的有效标志,为今后视网膜干细胞研究从功能角度提供了理论依据。3、所培养的视网膜干细胞能分化为功能性神经元,可以发放动作电位。今后若能将特异性诱导分化与膜片钳技术相结合,对特异性诱导分化后的细胞进行功能检测,对于探讨诱导不同类型视网膜神经元的调节机制有重要的作用。4、细胞不同的电生理学特性与细胞不同的形态构筑有一定的相关性,但尚缺乏一套完整的对应机制,有待于深入研究,将功能与形态完美结合。第四部分视网膜色素变性疾病发展过程中内源性视网膜干细胞的鉴定采用RCS大鼠作为先天遗传性视网膜色素变性疾病模型,初步观察视网膜色素变性疾病过程中内源性视网膜干细胞的存在、定位,为寻求挽救视网膜色素变性患者的视功能新的治疗途径提供实验依据。本研究指出,RCS大鼠不同发育阶段均发现内源性视网膜干细胞的存在,遗传性视网膜色素变性可能作为一种慢性刺激因素激活了自身内部潜在的视网膜干细胞。本研究取得的主要结论如下:1、大鼠视网膜干细胞的冻存复苏并不影响其原有的增殖及分化特性,有利于为今后建立“人视网膜干细胞库”提供方法学基础。2、新生大鼠视网膜混合细胞可能分泌某种物质,可以提高视网膜干细胞向光感受细胞的分化比率,而成熟大鼠视网膜混合细胞不具备此功能,可能与特定阶段视网膜细胞外液微环境中分化信号的不同有关系。3、应用全细胞膜片钳法成功记录视网膜干细胞分化不同阶段细胞上表达的多种不同电压门控离子通道,证实了用全细胞膜片钳法进行干细胞分化后离子通道细胞功能检测分析的可行性。采用细胞内注射技术,能清晰地显示在普通显微镜下不能很好观察的细胞形态。这将不仅有利于今后采用膜片钳技术进一步深入研究视网膜干细胞电生理学特性,而且对干细胞的形态特性及功能分析的结合研究提供了很好的研究手段。4、干细胞分化过程中逐渐发育出电压门控性离子通道,这些通道支持短时程、反复性动作电位的发放;视网膜干细胞与其不同分化阶段神经样细胞拥有不同的电压门控性电流,阐述了视网膜干细胞及其分化细胞在细胞功能水平的标志,为今后视网膜干细胞移植从功能角度提供了理论依据。5、大鼠视网膜干细胞分化过程中逐渐发育出电压门控性离子通道,离子通道出现的先后顺序是钾通道先表达,钠通道后表达。钠电流表现为从无到有,电流峰值即使在同一分化时间也大小不一。推测离子通道的发育是神经元分化过程中的重要环节,为今后视网膜干细胞研究从功能角度提供了理论依据。6、细胞膜的动作电位与钠通道的开放有关。视网膜干细胞分化过程中,当钠通道逐渐发育成熟产生钠离子电流后,进一步分化方可成为可以发放动作电位的功能性神经元,表明离子通道的发育是视网膜干细胞分化成具有功能的成熟神经元的有效标志。7、本研究对视网膜干细胞不同分化阶段的形态构筑、特异性分化特点及其电生理学特性之间的关系进行了初步探讨,进一步将三者有机结合研究具有非常重要的意义,目前尚缺乏一套完整的对应机制,有待于深入研究,将功能与形态完美结合。8、视网膜色素变性过程中可能产生某种慢性刺激因子激活了RCS大鼠自身内部潜在的视网膜干细胞。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 大鼠视网膜干细胞生物学和电生理学特性研究
• 前言
• 第一部分 大鼠视网膜干细胞的培养、鉴定及有效冻存
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 细胞外液微环境对大鼠视网膜干细胞影响的研究
• 第一节 新生大鼠视网膜细胞外液微环境对大鼠视网膜干细胞特异性诱导分化的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 变性视网膜细胞外液微环境对大鼠视网膜干细胞的影响
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 大鼠视网膜干细胞电生理学特性检测
• 第一节 大鼠视网膜干细胞及其诱导分化不同阶段 细胞电生理学特性检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 视网膜色素变性疾病发展过程中对内源性视网膜干细胞的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 视网膜干细胞研究现状
• 参考文献
• 文献综述二 视网膜色素变性的分子病因学研究及治疗进展
• 参考文献
• 博士在读期间发表的论文