小麦黄花叶病毒遗传变异及小麦品种的抗性分析

论文摘要

禾谷多黏菌（Polymyxa graminis L.）传播的小麦病毒病是一类世界性病害,广泛分布于欧洲、北美洲和东亚地区,引起严重的产量损失。在中国禾谷多黏菌传播的小麦病毒有两种,分别是小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）和中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）,在我国大部分的冬麦区发生危害。目前生产上唯一有效的防治措施是种植抗病品种。为了指导品种合理布局,有效控制WYMV和CWMV,本研究对WYMV和CWMV的分布变化,WYMV的分子变异,小麦品种抗性评价,病毒病对推广品种产量的影响,抗WYMV机制分析和WYMV-CP功能等方面进行了研究。为了进一步明确目前这两种病毒在我国的分布,特别是重病区、复合侵染区的分布及变化,2008-2010年,采用田间病症观察结合免疫学检测、电镜观察等方法,对WYMV和CWMV的分布进行了研究。结果表明,WYMV重病区呈现向西、向北扩展的趋势,发现山东泰安,河南商丘,湖北丹江口、襄樊、随州等WYMV新病区,江苏省两种病毒复合侵染区也在扩大,四川省仅在内江市零星发生,浙江小麦种植区未检测到病毒。为了研究WYMV种群结构、分子变异和遗传进化特点,我们对不同病区WYMV分离物CP序列和VPg序列进行了分析,结果发现不同分离物之间CP变异比VPg变异更显著。在WYMV-CP氨基酸序列上存在稳定的共变异现象,即Ile112→Val112和Asn115→Asp115,按照这种共变异可以将病毒分为三组:A（IEHN）、B（VEHD）和C（IEHD）,病毒类型与分布有一定相关性。在江苏省及周边地区WYMV类型主要是A,在冬小麦种植区北部和西部WYMV类型主要是B,在中国冬小麦区的边沿地带荣成、雅安、杭州和日本一致,类型为C。分子变异是病毒突破小麦抗性的遗传基础,不同地区品种抗性反应可能存在差异。为评价小麦品种在不同病区的抗性差异,筛选抗病小麦品种和种质资源,验证病毒共变异与致病性的关系。在2008-2011年,选择河南西平、江苏扬州、山东烟台和荣成4个有代表性的病区,进行小麦品种田间抗性鉴定,筛选出一批符合不同地区需要的抗病推广品种,适合烟台地区的抗病品种有淮麦20、郑麦366、丰抗1号、0448、小偃5号、陕麦150、西农2208、衡观111、兰天23号和中麦9号等10个。适合荣城地区种植的抗病品种只有烟农23;适合江苏扬州种植的抗病品种有:科优1号、高优503、高优505、花培2号等共24个。适合河南西平种植的抗病品种:阜麦936、高优503、旱抗4118、新麦208、豫麦70、豫麦70-36、郑麦366、郑麦9023等共65个。同时鉴定出大量感病品种,应该避免在病区种植。本研究还筛选出若干适合不同地区,可以用于抗病育种的小麦种质。另外,根据小麦品种抗病反应差异,推测烟台、扬州和西平为不同的致病株系,烟台分离物致病能力更强。为了评价推广品种对WYMV的抗性,于2006—2010年在河南省西平县进行了田间抗性鉴定试验和室内间接ELISA检测,并分析了病害严重程度对产量的影响。结果表明,在供试的62个品种中,仅有新麦208表现为免疫;豫麦70-36、泛麦5号、阜麦936、山东95519、豫麦70、高优503、豫麦9676、郑麦366和陕麦229等9个品种表现为抗病,占供试品种的14.5%;濮优938、兰考矮早8、新原958、花培2号、温优1号、豫麦18、郑麦9023、豫麦47、豫农201、偃展4110、豫麦36、百农878和豫麦49-198等13个品种表现为中抗,占供试品种的21.0%;另外39个品种表现为感病,占供试品种的62.9%。对其中48个品种进行了产量与病害严重度分析,发现随着病害的严重度增加,小麦的穗数、千粒重以及产量都有明显下降,严重度为1级时,平均减产9.6%;严重度达到2和3级时,平均减产分别为30.3%和33.5%。为了研究小麦品种可能的抗WYMV机制,利用Western-blotting及组织免疫印迹技术分析了病毒在抗、感病品种不同组织内分布,结果发现小麦品种的抗病机制存在多样性,有的品种如宁麦资32和临麦7号,对病毒表现高抗或免疫;品种如XK0106-108D6、豫麦70-36和阜麦936,表现为影响病毒的复制及在根部的扩散;品种如陕8242-1、西农889、中麦12号,表现为阻止病毒由根向茎上部的运输;品种如有芒白15、襄麦81、咸农151,表现为降低了病毒在叶部的积累。感病小麦因品种不同,植株内病毒含量也存在明显差异,观0014、扬06-（NX）-71、扬06-129和扬麦11等品种全株病毒含量都很高;陕159、豫农202、绵麦185和烟农22等品种,根和心叶病毒含量高,但是茎含量低;0448和望麦15等品种,根和茎病毒含量低,但叶片含量高。为了研究WYMV编码蛋白与CP的互作关系和CP在植物细胞中的定位,利用酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）和双分子荧光互补分析（Bimolecular fluorescence complementation,BiFC）技术,结果表明CP-CP,CP-P1存在互作,酵母双杂交的研究结果表明CP缺失C端94个氨基酸后,自身互作增强。同时利用农杆菌瞬时表达体系结合荧光显微技术分析CP蛋白在离体情况下植物细胞内定位特点,发现CP在烟草表皮细胞内的移动与微丝密切相关,与内质网及其形成的囊泡以及微管无关,CP定位在微丝上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1 禾谷多黏菌传播的小麦病毒研究进展
• 1.1 禾谷多黏菌传播的小麦病毒种类与分布
• 1.2 症状与危害
• 1.3 WYMV 和CWMV 生物学特性
• 1.4 病害流行学
• 1.5 病害的防控
• 1.6 WYMV 分子生物学研究
• 2 本研究的目的和意义
• 第2章 禾谷多黏菌传小麦病毒病在中国的分布与发生动态
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 田间调查与样品采集
• 1.2.2 病毒提纯
• 1.2.3 抗血清制备与效价测定
• 1.2.4 电镜观察鉴定
• 1.2.5 文献的整理
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒提取与抗血清制备
• 2.2 2008-2010 年田间调查，样品采集及检测结果
• 2.3 2000 年前禾谷多黏菌传小麦病毒病的发生危害情况
• 3 讨论
• 第3章 WYMV 分子变异分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA 提取
• 2.2 CP 和VPg 基因克隆、测序
• 2.3 CP 和VPg 核苷酸序列分析
• 2.4 CP 氨基酸序列变异分析
• 2.5 CP 氨基酸序列共变异的验证
• 2.6 共变异生物学意义分析
• 2.7 BaYMV 共变异分析
• 3 讨论
• 3.1 种群结构
• 3.2 共变异分析
• 第4章 品种抗病性评价
• 1 材料与方法
• 1.1 试验地点及设计
• 1.2 小麦品种
• 1.3 调查的时间
• 1.4 调查标准
• 1.5 间接ELISA 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 小麦品种抗病性评价结果
• 2.2 小麦品种在扬州、西平和烟台试验田的抗性差异
• 2.3 小麦品种在西平和扬州试验田的抗性差异
• 2.4 小麦品种在烟台和荣成试验田抗性差异
• 3 讨论
• 3.1 抗病品种
• 3.2 病毒致病株系分析
• 3.3 品种抗性机制
• 第5章 推广品种抗性评价及病毒对小麦产量品质的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验设计
• 1.2.2 调查和评价方法
• 1.2.3 ELISA 检测
• 1.2.4 产量及主要产量形成因子的调查
• 1.2.5 病毒对小麦品质的影响
• 1.2.6 数据的统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 发病情况调查与抗性评价
• 2.2 穗数，千粒重和产量的调查结果
• 2.3 病害严重度与穗数，千粒重和产量的关系
• 2.4 WYMV 对小麦品质的影响
• 3 讨论
• 第6章 不同类型小麦品种各组织中WYMV 分布
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 田间调查及组织免疫学检测结果
• 2.2 Western blotting 检测结果
• 3 讨论
• 第7章 WYMV 的CP 与其他蛋白的互作及其在植物细胞中的定位
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 CP 自身以及与病毒编码的其他蛋白互作分析
• 2.2 CP 在烟草细胞中的定位
• 3 讨论
• 第8章 主要结论与进一步研究建议
• 1 主要研究结论
• 1.1 变化动态
• 1.2 WYMV 变异分析
• 1.3 品种抗性鉴定及WYMV 的株系研究
• 1.4 品种的抗病机制分析
• 1.5 病害严重程度与小麦产量
• 1.6 WYMV-CP 功能分析
• 2 进一步研究的设想和建议
• 2.1 病害防控
• 2.2 品种的抗病分子机制
• 2.3 WYMV-CP 功能分析
• 2.4 研究WYMV 与小麦互作的机制
• 参考文献
• 附录Ⅰ 缩略词
• 附录Ⅱ 常用培养基缓冲溶液配制
• 附录Ⅲ 载体
• 附录Ⅳ 攻读博士期间投稿和录用与本研究相关的文章
• 致谢